瘤胃纖維素降解菌系對滅菌水稻秸稈結構性碳水化合物降解的影響

李君風，趙杰，唐小月，代童童，董東，宗成，邵濤

（南京農業大學草業學院飼草調制加工與貯藏研究所，江蘇南京 210095）

農作物秸稈是自然界中最豐富、最廉價的反芻動物飼料資源，開發利用適合于南方氣候條件下龐大的“非常規飼料資源”，并將其調制成優質青貯飼料是促進當地節糧型畜牧業發展的有效措施。農作物秸稈粗纖維含量高，水溶性碳水化合物含量低，難以調制出優質青貯飼料。目前許多研究通過添加外源纖維素酶，達到改善青貯發酵品質的目的，但由于酶制劑成本高、性能不穩定及pH 適應范圍較狹窄等因素，限制了其在青貯中的廣泛應用［1-2］。因此獲得能高效降解農作物秸稈粗纖維的微生物資源是農作物秸稈飼料化利用的關鍵。纖維素降解菌具有安全、低成本和適應性廣等優點，可降解植物中的結構性碳水化合物，并將其轉化為單糖進而被乳酸菌利用。

近年來，隨著人們對微生物群體功能的認識逐步加深，開始關注自然條件下微生物之間互作協同作用，并將這一理念應用于纖維素降解的研究與實際應用中［3］。纖維素降解復合菌系是由多種不同的細菌群落組成，它們能夠分泌降解能力強、種類多的纖維素降解酶［4］。復合菌系產生的酶系種類較單菌株更為多樣，進而能避免單菌株降解粗纖維時的底物抑制和反饋抑制因素［5］。反芻動物瘤胃是自然界中完善的天然消化發酵體系和微生態系統，被喻為豐富的纖維素降解菌資源庫［6］。從反芻動物瘤胃中篩選出高效而穩定的兼性厭氧纖維素降解復合菌系，將其作為青貯添加劑來改善發酵品質和消化率，更具有安全性、適應性和實際應用價值。添加纖維素降解復合菌系，可有效地降低纖維素的結晶度、增加孔隙和表面積，可促進酶與底物相互接觸并反應，提高酶解糖化率［7］，釋放水溶性碳水化合物供乳酸菌利用，快速產生乳酸降低pH，抑制有害微生物的活性，提高青貯飼料發酵品質、適口性和消化率。Ren 等［8］發現在甜高粱（Sorghum bicolor）青貯中添加不同水平的瘤胃液能有效地改善甜高粱發酵品質，增加結構性碳水化合物的降解，提高乳桿菌屬（Lactobacillus）的豐富度。Zhao 等［9］將2 株具有較高纖維素酶活性的瘤胃源纖維素降解菌分別添加到象草（Pennisetum purpureum）、全株玉米（Zea mays）、甜高粱中青貯120 d 后，均降低了青貯飼料的粗纖維含量，釋放出水溶性碳水化合物，改善了發酵品質。此外，瘤胃微生物能有效地分泌降解水稻（Oryza sativa）秸稈粗纖維所需的輔助酶，易獲得纖維素側鏈，促進了復合菌系對植物多糖的降解能力［10］。因此挖掘與利用青貯用瘤胃高效纖維素降解微生物資源，豐富特色功能性微生物種質資源庫，對優質青貯飼料生產具有重要的實際意義。

本試驗從黑白花奶牛瘤胃中篩選高效兼性厭氧纖維素降解復合菌系，探討其對水稻秸稈青貯過程中結構性碳水化合物降解及發酵品質的影響，為纖維素降解復合菌系在農作物秸稈青貯飼料生產中的應用及新型青貯添加劑的研制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養基

試驗材料為成熟期的水稻（Yongyou No. 9），來自寧波市農機畜牧中心試驗地（29.87° N，121.53° E，海拔6 m，浙江），于2019 年7 月28 日將成熟期的水稻進行刈割，并去除稻穗，切短（1~2 cm 左右）后，充分混合。隨機取6 份鮮樣，進行化學及微生物成分分析。瘤胃內容物收集于寧波市奶牛場黑白花奶牛［年齡在3 周歲，體重為（750±30）kg］。蛋白胨纖維素（peptone cellulose solution，PCS）培養基（g·L-1）：1 g 酵母膏，5 g 蛋白胨，2 g CaCO3，5 g NaCl，以1%水稻秸稈（堿性處理后）和0.3 g Whatman NO.1 濾紙為碳源。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、布什乳桿菌（Lactobacillus buchneri）為本實驗室的乳酸菌。將其分別活化兩次后接入deMan-Rogosa-Sharpe 液體培養基，于30 ℃培養24 h 后，用生理鹽水調為1.0×108cfu·mL-1。

1.2 試驗方法

1.2.1黑白花奶牛瘤胃兼性厭氧纖維素降解復合菌系的篩選及鑒定 采集黑白花奶牛瘤胃內容物，將勻漿處理后的1 mL 濾液接種至裝有50 mL 蛋白胨纖維素液體培養基（PCS）的血清瓶中，39 ℃下厭氧振蕩培養6 d 后，按2%的接種量，轉接至新的培養基中，重復6~9 次獲得穩定的菌系，剛果紅染色初篩，耐酸誘導復篩，觀察不同時間點復合菌系對濾紙的崩解效果（圖1），篩選出濾紙崩解速度快、降解程度明顯的復合菌系作為復篩復合菌系［11］。經酶活力測定，獲得高效兼性厭氧纖維素降解復合菌系M6；收集培養液提取菌體DNA，對樣品DNA 送樣進行高通量測序分析（上海美吉生物醫藥科技有限責任公司），利用Illumina Miseq PE300 平臺測序［12］。

圖1 不同培養時間點復合菌系對濾紙的崩解效果Fig. 1 Disintegration of filter paper by microbial consortium during culture

將復合菌系M6 接種于以水稻秸稈為碳源的PCS 培養基中，于150 r·min-1、37 ℃條件下，培養6 d，每隔24 h取 樣 離 心，上 清 液 在10000 r·min-1下，離 心10 min，依 據Miller［13］和Luo 等［14］的 方 法，分 別 以 微 晶 纖 維 素（microcrystalline cellulose，MCC）、羧甲基纖維素（carboxymethylcellulose，CMC）、水楊苷和木聚糖為底物，測定外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的活力。每分鐘產生1 μmol 還原糖（葡萄糖或木糖）的酶量為1 個酶活力單位（U）［15］。每個酶活力測定設5 個重復。

1.2.2青貯飼料的調制 稱取120 g 切短的水稻秸稈裝填至聚乙烯袋中（45 cm×35 cm），用真空包裝機（DZD-400，南京奧米泰科技有限公司）迅速抽真空及熱塑封口。共計72 個青貯袋，其中54 個青貯袋用于γ 輻射滅菌，輻照源為60Coγ，輻射劑量為32 kGy，輻射時間為4 h［16］。試驗設4 個處理組：1）CK：新鮮水稻秸稈直接青貯；2）IRR：滅菌后水稻秸稈青貯；3）CLAB：滅菌水稻秸稈接種復合乳酸菌（包括植物乳桿菌>5×108cfu·g-1FW，戊糖片球菌>2×108cfu·g-1FW 和布什乳桿菌>2×108cfu·g-1FW）；4）M6：滅菌水稻秸稈接種纖維素降解復合菌系M6，復合菌系M6 在Luria-Bertani（LB）培養基中培養48 h（OD600≈1.2），接種濃度為1×106cfu·g-1FW。分別于青貯后的第3、6、15、45、60 和90 天開袋，取樣分析各項指標。每個處理組各時間點分別設5 個重復。

1.2.3水稻秸稈青貯前后生物化學分析 將新鮮水稻秸稈和青貯飼料按照四分法取60 g，65 ℃烘干48 h 至恒重，測定干物質（dry matter，DM）含量，烘干樣品粉碎過1 mm 篩，用于測定粗纖維組分。采用范氏纖維分析法［17］，應用濾袋技術測定鮮樣及青貯飼料的中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、酸性洗滌木質素（acid detergent lignin，ADL）含量，纖維素含量為ADF 與ADL 之間的差值，半纖維素含量為NDF 與ADF 之間的差值。取20 g 青貯飼料樣品置于250 mL 錐形瓶，與120 mL 蒸餾水混合，在4 ℃冰箱靜置24 h 后，過濾提取浸提液，測定pH 值和有機酸［乳酸（lactic acid,LA）、乙酸（acetic acid,AA）、丙酸（propanoic acid,pa）、丁酸（butyric acid,BA）］含量。有機酸含量測定步驟參考宗成等［18］的方法，用安捷倫1260 型高效液相色譜儀測定（流動相：2.5 mmol·L-1H2SO4；流速：0.5 mL·min-1；溫度：55 ℃）。采用弗氏評分法［19］以青貯飼料中乳酸、乙酸、丁酸占總酸的比例為基礎來評價青貯飼料的發酵品質。得分在81~100 分為優；61~80 分為良；41~60 分為尚可；21~40 分為中；0~20 分為劣。

取10 g 新鮮水稻秸稈或青貯飼料于錐形瓶中，加入90 mL 蒸餾水混合，于37 ℃、150 r·min-1振蕩條件下培養1 h 后，分別利用deMan-Rogosa-Sharpe 瓊脂培養基（厭氧條件下在37 ℃恒溫培養箱中培養48 h）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（有氧條件下在28 ℃恒溫培養箱中培養48 h），對鮮樣和青貯飼料中的乳酸菌、酵母菌、霉菌進行平板計數［10］。剩余的青貯飼料進行真空冷凍干燥處理，稱取0.5 g 凍干樣品至10 mL 離心管中，經Millipore 水90 ℃浸提、活性炭和少量樹脂預處理離心，采用高效液相色譜法（安捷倫HPLC 1260，色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z，流動相：0.3%的乙腈氨水溶液，流速：0.5 mL·min-1，溫度：35 °C）測定青貯飼料中單糖和雙糖（葡萄糖、纖維二糖、果糖、木糖、蔗糖）含量，采用硫酸-蒽酮比色法測定總的水溶性碳水化合物（watersoluble carbohydrate，WSC）含量［20-21］。

1.3 數據處理

采用SAS 軟件GLM 程序對試驗數據進行方差分析（ANOVA），其模型為：Yijk= μ+αi+βj+αβij+ eijk，其中μ為平均值，αi為不同處理效應，βj為不同青貯時間效應，αβij為青貯時間與處理之間的交互作用，eijk為誤差。采用Tukey’s 多重比較法對處理組平均值進行比較，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解復合菌系M6 的細菌組成及各酶活力

本試驗從黑白花奶牛瘤胃中篩出一組兼性厭氧纖維素降解復合菌系M6。如圖2 所示，復合菌系M6 屬水平上主要微生物組成為埃希氏菌屬（Escherichia）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸球菌屬（Enterococcus），相對豐富度分別為48.59%、31.49%和19.83%。纖維素降解復合菌系M6 在以水稻秸稈為碳源的培養過程中，其各種酶活力如表1 所示，隨著培養時間的延長，各種酶活力逐漸上升。培養第6 天，外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活力均達到最大值，分別為2.71、3.44、1.59 和3.91 U·mL-1。

表1 纖維素降解復合菌系M6 的各種酶活力Table 1 Various enzyme activities of cellulolytic microbial consortium M6（U·mL-1）

圖2 兼性厭氧纖維素降解復合菌系M6 的細菌組成Fig. 2 Composition of facultative anaerobic cellulolytic microbial consortium M6

2.2 青貯前水稻秸稈的微生物成分和化學特性

新鮮和滅菌后水稻秸稈化學和微生物成分如表2 所示，滅菌后水稻秸稈各化學成分與滅菌前水稻秸稈幾乎沒有差異。滅菌后水稻秸稈沒有檢測到微生物，表明γ 射線能較好地消除水稻秸稈表面附著的微生物。

表2 滅菌前后水稻秸稈化學和微生物成分Table 2 Chemical composition and microbial population of fresh and irradiated rice straw prior to ensiling

2.3 水稻秸稈青貯發酵品質

表3顯示了水稻秸稈青貯過程中pH 值、有機酸含量和乳酸/乙酸（LA/AA）值的動態變化，不同處理組、青貯天數以及它們的交互作用顯著影響了乳酸（LA）含量、pH 和LA/AA 值（P<0.001）。各處理組pH 值（除IRR 組外）雖有波動，但整體呈下降趨勢。青貯3 d 后，M6 處理組pH 始終低于其他各組，且在青貯第60 天達到最低值4.62（P<0.05）。LA 含量在M6 處理組呈上升趨勢，而CK 和CLAB 呈先上升后下降趨勢。青貯45 d 后，M6 處理組LA 含量始終顯著高于其他各組（P<0.05），且在青貯90 d 達到最高值（23.90 g·kg-1DM）。隨著青貯的進行，乙酸（AA）含量在CK 和M6 處理組中呈上升趨勢，CK 和M6 處理組乙酸含量均高于其他兩組。整個青貯期間，各處理組中丙酸和丁酸含量均低于對照組（CK）。對青貯第90 天的水稻秸稈青貯飼料有機酸含量進行費氏評分，結果如表4 所示。CK 組的得分為32，青貯發酵品質中等；CLAB 與M6 組得分分別為69 和79，品質為良。

表3 水稻秸稈青貯過程中pH 值、有機酸含量和乳酸/乙酸的動態變化Table 3 Dynamic changes of pH value，organic acid content and lactic acid/acetic acid of rice straw silage

表4 青貯90 d 水稻秸稈發酵品質費氏評分Table 4 The Flieg score of fermentation quality of 90 days rice straw silage

2.4 水稻秸稈青貯過程中結構性碳水化合物降解

從表5 可知，處理和青貯時間均顯著影響水稻秸稈青貯飼料的NDF、ADF 和纖維素的含量（P<0.001）。整個青貯過程中，各結構性碳水化合物組分（除酸性洗滌木質素）整體呈下降趨勢。青貯15 d 后，NDF、ADF、纖維素含量在M6 組均顯著低于其他各組（P<0.05），半纖維素含量在M6 組也均低于其他各組，且在第90 天顯示最低的NDF（590.15 g·kg-1DM）、ADF（372.63 g·kg-1DM）、半纖維素（217.52 g·kg-1DM）和纖維素（318.61 g·kg-1DM）含量。青貯期間各組酸性洗滌木質素（ADL）含量差異不顯著（P>0.05）。

表5 水稻秸稈青貯過程中結構性碳水化合物組分變化Table 5 Changes in structural carbohydrates components of rice straw silage（g·kg-1 DM）

2.5 水稻秸稈青貯過程中水溶性碳水化合物組分變化

水稻秸稈青貯過程中水溶性碳水化合物（WSC）、蔗糖、纖維二糖、果糖、木糖和葡萄糖的動態變化如圖3 所示，不同處理、青貯時間和它們的交互作用均顯著影響水稻秸稈青貯過程中水溶性碳水化合物組分的含量（P<0.001）。青貯前15 d，除IRR 組，其他各處理組中WSC、蔗糖、果糖、木糖、纖維二糖和葡萄糖含量迅速下降，青貯15 d 后，WSC、蔗糖、果糖、木糖、纖維二糖和葡萄糖含量在復合菌系M6 組和滅菌組（IRR）保持相對較高水平，而對照組（CK）和乳酸菌處理組（CLAB），WSC、蔗糖、果糖、木糖、纖維二糖和葡萄糖含量持續下降，直到青貯結束時達到最低水平。青貯60 d 后，IRR 和M6 組各水溶性碳水化合物組分含量保持較高水平，其次為CLAB 組。

圖3 水稻秸稈青貯過程中水溶性碳水化合物，蔗糖，果糖，纖維二糖，木糖和葡萄糖的變化Fig. 3 Dynamic changes of residual water-soluble carbohydrates，sucrose，fructose，cellobiose，xylose，and glucose of rice straw silage

3 討論

本試驗經限制性誘導培養、剛果紅染色初篩，耐酸誘導篩選和濾紙降解復篩，從黑白花奶牛瘤胃中篩出一組兼性厭氧纖維素降解復合菌系M6。通過傳統微生物培養方法結合高通量測序對復合菌系M6 進行微生物多樣性分析，復合菌系M6 屬水平上主要微生物組成為埃希氏菌屬（Escherichia）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）。這些微生物在纖維素降解中比較常見，如Pang 等［22］從牛瘤胃中分離到的纖維素降解大腸桿菌ZH-4（Escherichia coliZH-4）具有細胞外纖維素酶活性，可降解培養基中的纖維素。Luo 等［14］對成年和幼年期長足大竹象蟲（Cyrtotrachelus buqueti）腸道中具有降解纖維素能力的微生物進行鑒定，發現含有乳球菌，且對其進行基因組分析，其富含糖苷水解酶（GH1 和GH3），推測其具有β-glucosidase 和β-galactosidase 活性［23］。Thet 等［6］從牛瘤胃液中篩出一株具有較高濾紙酶活力（FPase）的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。以上說明埃希氏菌屬、乳球菌屬和腸球菌屬的部分菌種具有產纖維素酶的基因，能夠分泌纖維素酶，降解纖維素。前期本實驗室已對復合菌系M6 進行生理生化試驗和酶學特性的研究，發現復合菌系M6 的綜合性狀優良，適宜于作為青貯添加劑。復合菌系M6 在以水稻秸稈為唯一碳源的誘導培養下，其各酶活力隨接種時間的延長不斷提高，并在培養第6 天達到最大值，其中木聚糖酶活性顯示最高為3.91 U·mL-1。復合菌系M6 能夠在無菌培養條件下分泌纖維素酶，并且能高效降解水稻秸稈，構成穩定的微生態體系，因此了解其生長產酶規律，對更好地研究和利用纖維素降解復合菌系具有重要意義。此外，復合菌系M6 纖維素酶活力動態的測定對于后續青貯發酵及實際應用具有重要的指導意義。

為了更加深入地評價復合菌系M6 降解粗纖維的效果，將復合菌系M6 添加到γ 輻射滅菌水稻秸稈青貯中，比較在無其他微生物的干擾條件下，復合菌系M6 對水稻秸稈結構性碳水化合物的降解效果。整個青貯過程中，CK 和CLAB 組乳酸含量呈先上升后下降趨勢，表明水稻秸稈自身附著的乳酸菌或添加的外源乳酸菌，在青貯前期可利用發酵底物產乳酸，但是發酵45 d 后，由于水稻秸稈自身附著的乳酸菌或添加的外源乳酸菌中有異型發酵乳酸菌存在，在底物不足的情況下，將乳酸轉化為乙酸，使乙酸含量升高。M6 處理組pH 始終低于其他各組，青貯第60 天達到最低值（4.62）。青貯45 d 后，M6 處理組LA 含量始終顯著高于其他各組，這表明復合菌系M6 對水稻秸稈青貯發酵品質的改善優于添加乳酸菌的效果，這與費氏評分結果相一致。水稻秸稈在復合菌系M6 的酶解作用下產生水溶性碳水化合物，而M6 中含有31.49%的乳球菌屬，乳球菌屬的存在可及時利用酶解下游的產物水溶性碳水化合物，產生乳酸，降低pH［24］，同時維持青貯過程中水溶性碳水化合物的含量，消除酶促反應中產物的抑制作用［25］，提高纖維素降解復合菌系的降解效率，進而有效地改善水稻秸稈的發酵品質。

青貯過程中添加纖維素降解復合菌系可有效地降低纖維素的結晶度、增加孔隙和表面積，促進酶與底物相互接觸并反應，提高酶解糖化率，釋放水溶性碳水化合物，為乳酸菌發酵提供更多的發酵底物［26］。本試驗青貯15 d后，水稻秸稈青貯飼料NDF、ADF、纖維素和半纖維素含量在M6 組均低于其他各組，且在第90 天達到最低的NDF（590.15 g·kg-1DM）、ADF（372.63 g·kg-1DM）、纖維素（318.61 g·kg-1DM）和半纖維素（217.52 g·kg-1DM）含量，表明添加復合菌系M6 加速了水稻秸稈結構性碳水化合物的降解。Castro 等［27］研究指出應用木質纖維素降解微生物，可以有效地提高農作物秸稈結構性碳水化合物的降解效率。利用微生物酶解作用降解植物細胞壁中的結構性多糖，破壞其細胞壁結構，使植物細胞壁內可利用的水溶性碳水化合物釋放出來，同時也增加了微生物或酶對半纖維素和纖維素的可接觸表面積，進一步將結構性多糖降解為單、雙糖，供乳酸菌利用，產生LA，降低pH。石偉［28］將3 株篩選于青藏高原野牦牛糞便中的具有較高纖維素酶活性的芽孢桿菌，按一定接種比例與乳酸菌組合后添加至全株玉米青貯30 d 后，其NDF 和ADF 含量分別降低了16.63%和15.85%。

纖維素降解菌的酶解作用可促進水稻秸稈中的結構性碳水化合物的降解，釋放出額外的WSC 以補充乳酸菌發酵所需的底物，促進乳酸發酵，降低pH，抑制有害微生物的活性，提高青貯發酵品質［29］。在青貯前15 d，各處理組（除IRR 組外）中WSC、蔗糖、果糖、木糖、纖維二糖和葡萄糖含量迅速下降，其后，M6 和IRR 處理組水溶性碳水化合物含量保持相對穩定的水平。IRR 組各指標表明，將滅菌后水稻秸稈直接青貯其各化學成分無顯著變化。纖維素降解復合菌系M6 使得青貯飼料保持了較高水平的WSC 含量，這是由于纖維素降解復合菌系降解結構性碳水化合物釋放水溶性碳水化合物所致［30］。丁健等［31］在玉米青貯過程中添加纖維素酶，結果顯示添加纖維素酶可產生纖維二糖和麥芽糖，顯著增加了六碳糖、五碳糖和衍生糖的含量。添加纖維素降解復合菌系，可以彌補菌株之間的產酶差異，有利于組成完整全面的酶系，充分發揮各酶之間的協同作用，提高纖維素酶的活性和降解能力，使各個菌株相互協調生長，并最大程度發揮復合菌系對結構性碳水化合物的降解能力。根據本試驗結果可推斷復合菌系M6 在水稻秸稈青貯中具有降解粗纖維和促進乳酸發酵的雙重作用。青貯過程中，M6 組乙酸含量明顯提高，這可能是由于微生物酶解使半纖維素脫乙酰化，產生五碳糖，部分異型發酵乳酸菌可利用五碳糖發酵成乳酸和乙酸［32］。此外，青貯過程中多聚糖的生物降解會影響乳酸菌發酵效率和代謝途徑。新鮮的牧草中游離戊糖很少，而在兼性厭氧纖維素降解復合菌系M6 分泌的半纖維素酶作用下可釋放部分戊糖［33］，戊糖（木糖）可部分被乳酸菌利用，從而積累更多的乙酸。綜上所述，盡管青貯過程中添加外源微生物（纖維素降解復合菌系或復合乳酸菌），最終發酵品質未達到優質青貯飼料的標準，但在一定程度上促進了乳酸發酵，降低pH 值，改善水稻秸稈青貯發酵品質，其中復合菌系M6 改善效果最佳；在此也進一步提示對于類似于水稻秸稈的青貯原料，水溶性碳水化合物嚴重不足，僅僅依靠添加外源微生物（纖維素降解復合菌系或復合乳酸菌）提高其發酵品質的策略仍不夠，需與添加外源發酵底物相結合，才能達到理想的效果。

4 結論

與水稻秸稈自然發酵或添加復合乳酸菌相比，添加纖維素降解復合菌系M6 降低了水稻秸稈青貯飼料pH值，提高了LA 含量和LA/AA 值，維持了較高的水溶性碳水化合物含量，改善了水稻秸稈青貯發酵品質，復合菌系M6 在水稻秸稈青貯中具有降解粗纖維和促進乳酸發酵的作用，在青貯飼料生產中具有良好的應用前景。