運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究氧化苦參堿治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制*

葉柏柏，林城，王心寧，常征輝，李林福

1.贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)屬于膝關(guān)節(jié)退行性病變，故又稱退行性關(guān)節(jié)炎，通常表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)軟骨變形、破壞及增生等特點(diǎn)，因其患病人數(shù)和患病率都位列世界排行首位，被世界衛(wèi)生組織定義為“第一致殘疾病”，致殘率高達(dá)53%[1]。據(jù)報(bào)道，OA已經(jīng)給患者帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前，我國(guó)OA患病率高達(dá)5.1%以上，而英國(guó)、美國(guó)成年人患病率就已高達(dá)5%～10%[2]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外依舊缺乏有效且經(jīng)濟(jì)的治療方法來治愈OA。

氧化苦參堿(oxymatrine，OM)是苦參堿類生物堿，大量研究表明，其有多種生理藥性，如抗心律失常、抗感染、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)肝臟、抗病毒、抗氧化等[3-9]。OM有良好的藥代動(dòng)力學(xué)(ADME)特性，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到OM的OB(Oral Bioavailability)值為0.35，DL(Drug Like)值為0.28，而且OM的堿極性適中，易溶于水和醇類溶劑，方便藥物制劑。此外，OM在很多藥用植物中存在，具有來源廣泛的特性，尤其是苦參、苦豆子、白刺花等豆科植物中含量高達(dá)1%以上。基于上述成藥性好、經(jīng)濟(jì)易得的優(yōu)勢(shì)，使其具備良好的藥物開發(fā)前景。

有報(bào)道表明，OM治療OA具有顯著作用[10-11]。相對(duì)于其他常見的藥理活性，OM在治療OA方面的研究不多，尤其是機(jī)制方面不夠明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種高效的生物信息學(xué)工具，可用于預(yù)測(cè)活性成分治療疾病的候選靶點(diǎn)和潛在機(jī)制[12-13]。本課題組參照文獻(xiàn)[14]中采用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)OM治療OA的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的預(yù)測(cè)，并輔以分子對(duì)接驗(yàn)證，為后續(xù)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件本研究所涉及的一些數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件匯總，見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件匯總

1.2 獲取化合物目標(biāo)靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中以“oxymatrine”為化合物名稱項(xiàng)檢索詞來獲取OM的目標(biāo)靶點(diǎn)。同時(shí)，在ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)檢索中以“oxymatrine”為化合物名稱項(xiàng)檢索詞以獲取OM的mol2格式，再將OM的mol2格式分子結(jié)構(gòu)上傳到Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，靶點(diǎn)類型選擇“Human Protein Targets Only”，設(shè)定靶點(diǎn)數(shù)為300，完成在該平臺(tái)OM目標(biāo)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)。最后將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的目標(biāo)靶點(diǎn)合并去重，得到OM的目標(biāo)靶點(diǎn)。

1.3 獲取OA潛在作用靶點(diǎn)以“osteoarthritis”為疾病項(xiàng)檢索詞，在OMIM和Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索OA相關(guān)基因，合并從這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的基因，去重，將其相關(guān)基因編碼的蛋白作為藥物治療OA的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 OM和OA的交集靶點(diǎn)應(yīng)用Draw Venn Diagram在線服務(wù)平臺(tái)將OM(drug)的目標(biāo)靶點(diǎn)和OA(disease)的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集，將兩者交集出的靶點(diǎn)作為OM治療OA的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及篩選核心靶點(diǎn)于在線數(shù)據(jù)庫(kù)STRING 10.0 (http：//string-db.org) 中將獲取的交集基因上傳至“Multiple Proteins”項(xiàng)，在“Organism”項(xiàng)下選擇“Homo sapiens”“minimum required interaction score”選擇>0.70，在線生成PPI 網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算度值最前的20個(gè)核心基因，并繪制其柱狀圖。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析在Dvid V 6.7在線平臺(tái)(https：//david-d.ncifcrf.gov/home.jsp) 對(duì)交集所得到的基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。將閾值設(shè)定為P值<0.05后，取排在前20的GO term和KEGG通路，再用R包繪制氣泡圖進(jìn)行分析。

1.7 構(gòu)建交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件 (http：//www.Cytoscape.org/) 構(gòu)建交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡(luò)，將前面已獲取的交集靶點(diǎn)、GO富集分析結(jié)果和KEGG富集分析結(jié)果導(dǎo)入軟件，通過網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值(degree)的大小對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析以探究苦參堿治療OA的作用機(jī)制。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證先以“oxymatrine”為關(guān)鍵詞在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索下載其2D結(jié)構(gòu)的SDF文件，再?gòu)腞CSB PDB下載篩選出來的核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的PDB文件，運(yùn)行Discovery studio 2019軟件將化合物小分子與核心靶點(diǎn)蛋白大分子對(duì)接驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 OM治療OA的潛在靶點(diǎn)基于數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)Pharm Mapper及TCMSP在線檢索得到的化合物靶點(diǎn)經(jīng)合并去重后，共得到155個(gè)OM目標(biāo)靶點(diǎn)；基于數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)OMIM和Gene cards在線檢索得到的疾病相關(guān)基因經(jīng)合并去重后，共得到3 114個(gè)OA相關(guān)基因。兩者經(jīng)過韋恩圖交集，共得到80個(gè)OM治療OA的潛在靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 交集后得到的OM治療OA的潛在靶點(diǎn)

2.2 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及篩選核心靶點(diǎn)將OM和OA的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)中，再選擇互作評(píng)分>0.70，得出PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將離散點(diǎn)隱藏，統(tǒng)計(jì)得到244條邊和72個(gè)節(jié)點(diǎn)。按照度(degree)值排序篩選出最高的前30個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)。核心節(jié)點(diǎn)是指某蛋白質(zhì)擁有的邊數(shù)為所有蛋白質(zhì)平均邊數(shù)兩倍以上的節(jié)點(diǎn)，即擁有的邊數(shù)>13.56。由圖2B可知，前30個(gè)蛋白質(zhì)均>26，都為核心節(jié)點(diǎn)。其中，排名前5位的依此為：AKT1(26)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)(26)、SRC(23)、MYC(19)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)(18)，見圖2。

注：A：交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖；B：前30個(gè)核心交集基因柱狀圖圖2 交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖和前30個(gè)核心交集基因柱狀圖

2.3 GO term富集分析采用DAVID在線服務(wù)平臺(tái)對(duì)OM治療OA涉及的80個(gè)蛋白質(zhì)的GO term進(jìn)行富集分析。對(duì)分析所得的結(jié)果進(jìn)行篩選，設(shè)定 p.adjust<0.05以及FDR<0.05，涉及到分子功能的條目共有119個(gè)，再按照P值列出前20個(gè)較為顯著的條目，見圖3。由圖3可知，OM治療OA時(shí)涉及的基因功能主要有：endopeptidase activity(內(nèi)肽酶活性)、DNA-binding transcription factor binding(DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合)、DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase II-specific(DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA 聚合酶 II 特異性)、DNA-binding transcription activator activity(DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性)、nuclear receptor activity(核受體活性)。

圖3 交集基因GO term富集的前20個(gè)條目

2.4 KEGG通路分析采用DAVID在線服務(wù)平臺(tái)對(duì)OM治療OA涉及的80個(gè)蛋白質(zhì)的KEGG通路進(jìn)行富集分析。對(duì)分析所得結(jié)果進(jìn)行篩選，設(shè)定p.adjust<0.05以及FDR<0.05，涉及到治療OA的信號(hào)通路共有129個(gè)，再按照P值列出前20個(gè)較為顯著的條目，見圖4。由圖4可知，OM用于治療OA時(shí)涉及的信號(hào)通路主要有：proteoglycans in cancer (癌癥蛋白聚糖)、PI3K-Akt signaling pathway(磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 B 信號(hào)通路)、Lipid and atherosclerosis(血脂和動(dòng)脈粥樣硬化)、MAPK signaling pathway(MAPK信號(hào)通路)、Chemical carcinogenesis receptor activation(化學(xué)致癌受體激活)、Prostate cancer(前列腺癌)。

圖4 交集基因KEGG通路富集的前20個(gè)條目

2.5 交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡(luò)分析如圖5所示，在交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡(luò)圖中，涉及到OM治療OA的交集基因有63個(gè)節(jié)點(diǎn)、GO term有10個(gè)節(jié)點(diǎn)和KEGG信號(hào)通路有10個(gè)節(jié)點(diǎn)。其中，長(zhǎng)方形為交集基因，三角形為GO term，V形為KEGG信號(hào)通路，每?jī)蓚€(gè)節(jié)點(diǎn)之間有連接就說明他們之間有潛在的聯(lián)系，GO term-交集基因邊106條以及KEGG信號(hào)通路-交集基因邊143條，這說明OM治療OA時(shí)，可能涉及多個(gè)靶點(diǎn)，有多種生物效應(yīng)共同參與，并存在多種作用機(jī)制。按度值大小排序，前五的交集基因依次為：RELA(13)、AKT1(12)、ESR1(9)、GRB2(9)、PPARA(9)。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果將從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索下載得到的OM三維結(jié)構(gòu)(SDF格式)與篩選出前5個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。小分子與靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果為：Libdockscore>100時(shí)，表明兩者能夠自由、穩(wěn)定對(duì)接。如表2所示，OM與各靶點(diǎn)對(duì)接得到的Libdockscore均>92，表明OM和核心靶點(diǎn)能夠相對(duì)穩(wěn)定地對(duì)接，見表3。由圖6可知，OM主要是通過傳統(tǒng)氫鍵、碳?xì)滏I、P-Pi共軛、堿基孤對(duì)電子與靶點(diǎn)結(jié)合。

注：長(zhǎng)方形為交集基因，三角形為GO term，V形為KEGG信號(hào)通路圖5 交集基因-GO-KEGG網(wǎng)絡(luò)圖

表2 分子對(duì)接結(jié)果

圖6 Oxymatrine與核心靶點(diǎn)對(duì)接示意圖

表3 基因表達(dá)蛋白及蛋白R(shí)CSB號(hào)

3 討論

OA是由于關(guān)節(jié)退行性功能失調(diào)引起的慢性疾病，病因包括老年化、肥胖、運(yùn)動(dòng)損傷、炎癥及遺傳易感性等[15]，該病程所涉及的生物效應(yīng)數(shù)不勝數(shù)，分子機(jī)制更是復(fù)雜，已經(jīng)報(bào)道證實(shí)的就有PERK/Bip信號(hào)通路、p38MAPK信號(hào)通路、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、TLR/MyD88信號(hào)通路、TGF-β /BMPs信號(hào)通路、細(xì)胞骨架信號(hào)通路，以及某些與他們存在cross-talk的信號(hào)通路等[16-20]。使用不同的活性成分治療OA，其治療過程中涉及的靶點(diǎn)、機(jī)制各有不同[21-23]。在本研究中，共交集得到80個(gè)OM治療OA的目標(biāo)靶點(diǎn)，獲取AKT1、IL-6、SRC、MYC和TNF等核心靶點(diǎn)，富集到119個(gè)GO條目和129條KEGG通路。GO條目和KEGG通路中，涉及最多的基因依次為：RELA、AKT1、ESR1、GRB2、PPARA。

本研究經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到AKT1、IL-6、SRC、MYC和TNF等核心靶點(diǎn)，表明OM治療OA時(shí)，上述蛋白質(zhì)參與的概率最高，被旁路激活的可能性最大。而如上述的GO條目和KEGG通路中涉及最多的基因?yàn)椋篟ELA、AKT1、ESR1、GRB2、PPARA。這表明，在優(yōu)選的GO條目和KEGG通路中，RELA、AKT1、ESR1、GRB2、PPARA的共有率最高。將兩種情況進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)均存有AKT1，表明其代表性較強(qiáng)，具有一定的研究意義，后續(xù)值得關(guān)注。

GO條目中，P值較為顯著的前5個(gè)依次為：endopeptidase activity(內(nèi)肽酶活性)、DNA-binding transcription factor binding(DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合)、DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase II-specific (DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA 聚合酶 II 特異性)、DNA-binding transcription activator activity(DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性)、nuclear receptor activity(核受體活性)，他們與OA的發(fā)病有著密切聯(lián)系。內(nèi)肽酶活性可催化多肽鏈中內(nèi)部α-肽鍵的水解，如MMP-3作為具有細(xì)胞外活性的鋅依賴性內(nèi)肽酶，在OA的產(chǎn)生過程中起著重要作用[24]。DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合則是通過與基因調(diào)控區(qū)內(nèi)特定的DNA序列相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性是指RNA 聚合酶II特異性激活或增加由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的特定基因集的轉(zhuǎn)錄。DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性可以通過激活或增加特定基因組轉(zhuǎn)錄來影響DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性。核受體活性是一種可以通過與DNA結(jié)合的方式來抑制或者減少特定基因組轉(zhuǎn)錄的輔助抑制活性。上述的后4個(gè)GO條目在細(xì)胞內(nèi)遺傳信息流通是極為常見的，OA的發(fā)生過程中也是必不可少的，如TNF-α誘導(dǎo)的MEK/ERK信號(hào)通路在產(chǎn)生OA時(shí)就涉及Egr-1的DNA 結(jié)合[25]。

KEGG信號(hào)通路中，P值較為顯著的前5個(gè)依次為：proteoglycans in cancer (癌癥蛋白聚糖)、PI3K-Akt signaling pathway(磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 B 信號(hào)通路)、Lipid and atherosclerosis(血脂和動(dòng)脈粥樣硬化)、MAPK signaling pathway(MAPK信號(hào)通路)、Chemical carcinogenesis receptor activation(化學(xué)致癌受體激活)、Prostate cancer(前列腺癌)。腫瘤微環(huán)境中的許多蛋白多糖對(duì)各種類型癌癥的生物學(xué)效應(yīng)如增殖、黏附、血管生成和轉(zhuǎn)移起著關(guān)鍵作用，還有些和生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等相關(guān)。癌癥蛋白聚糖信號(hào)通路中存在cross-talk，可激活TGF-β /BMPs、Wnt/β-catenin、p38MAPK、PI3K-Akt等能誘導(dǎo)OA的信號(hào)通路。血脂和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路一般是通過激活PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、TLR/MyD88信號(hào)通路來產(chǎn)生作用。化學(xué)致癌受體激活信號(hào)通路則是通過激活PI3K-Akt信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。前列腺癌信號(hào)通路可激活PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路來起作用。此外，上述5條KEGG信號(hào)通路均涉及到細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致OA的重要原因。因此，OM可能通過上述信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)OA的治療作用。

運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證OM與各靶點(diǎn)的結(jié)合性能時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)接得到的Libdockscore為92～107，說明OM對(duì)核心靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合能力，但并非十分穩(wěn)定。分析OM與各核心靶點(diǎn)的分子間作用力種類與數(shù)量，發(fā)現(xiàn)主要依靠數(shù)目較少的傳統(tǒng)氫鍵、P-Pi 共軛、堿基孤對(duì)電子進(jìn)行結(jié)合，甚至有的主要依靠碳?xì)滏I這種弱作用力進(jìn)行結(jié)合，結(jié)合能力相對(duì)較弱。已有研究表明，由于苦參堿類天然生物堿的自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其與眾多靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接時(shí)的Libdockscore都偏低[26]。生物堿類具有較強(qiáng)生理活性的同時(shí)，也有較大的不良反應(yīng)，這種相對(duì)較弱的結(jié)合能力，亦可能是自然藥學(xué)觀下的機(jī)體保護(hù)作用，即藥物與受體結(jié)合發(fā)揮藥效之后盡快解離以免產(chǎn)生過多的不良反應(yīng)。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)氧化苦參堿治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)及分子對(duì)接驗(yàn)證，并分析了前五個(gè)最為核心的靶點(diǎn)、GO條目及KEGG通路，為后續(xù)研究的模型選擇、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提供了信息導(dǎo)向。