基于網絡藥理學探討火麻仁治療便秘的作用機制*

李煥

陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046

便秘是一種消化系統常見癥狀，以功能性便秘(functional constipation，FC)居多[1]，其特點有大便次數減少、排便難，或兩者兼有，排便難包括排便費力、大便不盡感、糞便干、大便時間延長，甚至需手法輔助排便等。便秘主要有三種類型，分別為功能性便秘、緩慢的傳輸和排泄功能障礙[2]。慢性便秘的病程至少6個月[3]。目前文獻報道，我國普通成年人群便秘的患病率為3.19%～11.6%[4-7]，且患病率隨年齡上漲而增加，有研究發現，便秘主要發生在女性患者中，同時社會經濟地位較低的人群便秘患病率也較高[8]。慢性便秘的反復發作雖不危及生命，但會增加高血壓、心腦血管疾病、缺血性卒中的致死率[9]，降低患者的生活質量。目前，臨床上治療便秘的藥物沒有統一規范，化學藥物和中藥均廣泛運用[10]，主要可分為四類：刺激性瀉劑、滲透性瀉劑、促分泌劑、促動力劑[11]。

中醫認為，便秘的主要病因為大腸傳導失常、胃腸積熱、機體津虧血少、氣虛陽衰、陰寒積滯和氣機郁滯等[12]。中醫藥治療便秘積累了豐富的臨床經驗，如 《傷寒論》中的蜜煎導法，所記載的麻子仁丸至今仍廣泛使用，該方中火麻仁作為君藥發揮了顯著作用[13]。火麻仁，味甘，性平，歸脾、胃、大腸經，有“潤燥滑腸”的功效[14]，主要用于血虛津虧腸燥型便秘。《本草述》言“麻子仁，非血藥而有化血之液，不益氣而有行氣之用”，其化血作用對津血虧虛的便秘更為適用[15]。火麻仁可與厚樸、枳實配伍以通暢氣機、瀉濁通腑；也可配伍玄參、生地黃增液通腑；配伍大黃以通腑瀉熱、導痰下行[16]。現代藥理證實，火麻仁富含的脂肪油可刺激腸黏膜，使分泌增多，蠕動加快，減少大腸吸收水分，從而發揮瀉下的作用[17]。

網絡藥理學這一概念由Andrew L Hopkins于2007年首次提出[18-19]，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用，系統觀察藥物對疾病的影響，從而揭示藥物發揮作用的奧秘。網絡藥理學具有整體性、動態性的特點，多靶點的給藥模式突破了傳統的單靶點研究模式的束縛，從“網絡靶標”出發使傳統新藥研發理念發生變化，對中醫藥的整體性、系統性研究起到了重要支撐作用。本文將基于網絡藥理學對火麻仁治療便秘的有效成分及作用機制進行研究，以期為臨床中醫藥治療便秘提供思路。

1 資料與方法

1.1 火麻仁有效成分及相關靶點的挖掘藥物必須通過吸收、分布、代謝、排泄等過程到達靶器官或組織發揮作用，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)是篩選藥物成分的重要參數。OB是指藥物經口服進入人體后，被機體吸收進入全身血液循環的相對量和速率，是藥代動力學最重要的參數之一；DL是指化合物與Drug Bank數據庫里所有已知藥物之間的相似程度，類藥性指數越低，則表示該化合物越不適合作為藥物。采用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)[20]，在“Herb name”檢索框里輸入“火麻仁”進行檢索，篩選同時符合OB≥30%和DL≥0.18[21]這兩個條件的藥物活性成分，并提取藥物活性成分的相關靶點。篩選結束后，為使蛋白質靶點信息標準化，使用Uniprot蛋白質數據庫(https：//www.uniprot.org)[22]進行規范。

1.2 便秘疾病靶點的挖掘利用DisGeNET(https：//www.disgenet.org/)數據庫[23]、在線人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//www.omim.org)[24]、Drugbank數據庫以“constipation”為關鍵詞，檢索便秘相關治療靶點信息，Score值越大則代表該靶點與疾病關系越密切，設置Score≥0.9，將所得到的靶點整理成靶點數據集。

1.3 火麻仁治療便秘潛在作用靶點的篩選利用Draw Venn Digram(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線工具將火麻仁活性成分靶點與便秘疾病靶點進行映射，制作成韋恩圖，交集部分為火麻仁治療便秘的潛在靶點。

1.4 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建將潛在靶點蛋白以multiple proteins的形式上傳到STRING數據庫(https：//string-db.org/)[25]，研究物種選擇為“Homo Sapiens”，“minimum required interaction score”采用默認值0.400，“max number of interactors to show”采用默認參數，構建潛在靶點的蛋白作用關系網絡圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析利用DAVID數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)[26-27]對關鍵靶點進行GO功能富集分析。GO功能富集分析包括分子組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物過程(biological process，BP)三個部分。

1.6 京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析使用R語言軟件對潛在靶點進行ID轉換，運行R語言得到KEGG富集分析的氣泡圖。

1.7 “中藥-成分-靶點”網絡圖的構建及分析利用Cytoscape3.6.0軟件(https：//cytoscape.org/index.html/)[28]構建“中藥-活性成分-作用靶點”網絡圖，進一步探討火麻仁中藥的作用機制。

2 結果

2.1 火麻仁有效成分及相應靶點以OB≥30%和DL≥0.18為條件篩選得到火麻仁有效成分6個，分別為花生四烯酸(arachidonic acid)、谷甾醇(sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、二十碳烯醇(gondoic acid)、木犀草素(luteolin)、(Z)-3-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]acrylamide，見表1。活性成分相關靶點531個，通過初步去重及UniProt數據庫進一步篩選，共得到199個靶點。

表1 火麻仁活性成分信息表

2.2 便秘相關作用靶點及火麻仁治療便秘的潛在作用靶點設置Score≥0.9，利用DisGeNet數據庫、OMIM數據庫、Drugbank數據庫檢索并去重后得到便秘靶點742個。應用Draw Venn Diagram在線工具，繪制韋恩圖，通過靶點映射取交集共得到潛在作用靶點32個。見圖1。

圖1 火麻仁與便秘共有靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡圖將32個潛在作用靶點輸入STRING數據庫，得到火麻仁治療便秘潛在靶點蛋白相互作用網絡圖，如圖2，連線越密集的靶點越重要。該網絡圖共涉及32個節點，116條邊，平均自由度7.25。其度值前10的蛋白分別有：1型膠原(collagen type 1，Col1a1)、張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα,AKT1)、胰島細胞瘤細胞(islet cell tumor cells，INS-1)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、B細胞編碼κ輕鏈多肽抑制基因(Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-Cells，kinase gamma,IKBKG)、外周血過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor，PPARG)、髓細胞組織增生蛋白(myelocy tomatosis proteins)、肝細胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α，HNF1A)、雄激素受體(androgen receptor，AR)。

圖2 PPI網絡圖

2.4 GO富集分析采用DAVID數據庫對32個潛在靶點進行GO功能富集分析得到CC 15個條目，MF 27個條目，BP 123個條目。排名前10位的CC分別是細胞溶質(cytosol)、胞外區(extracellular region)、漿膜(plasma membrane)、細胞外空隙(extracellular space)、核漿(nucleoplasm)、線粒體(mitochondrion)、細胞外基質(extracellular matrix)、蛋白質復合體(protein complex)、膠原蛋白三聚物(collagen trimer)、內質網腔(endoplasmic reticulum lumen)；排名前10位的MF分別是蛋白結合(protein binding)、相同的蛋白結合(identical protein binding)、序列特異性DNA結合轉錄因子活性(transcription factor activity，sequence-specific DNA binding)、鋅離子結合(zinc ion binding)、轉錄調控區DNA結合(transcription regulatory region DNA binding)、轉錄因子結合(transcription factor binding)、酶結合(enzyme binding)、異源二聚體蛋白活性(protein heterodimerization activity)、序列特異性DNA結合(sequence-specific DNA binding)、同源二聚體蛋白活性(protein homodimerization activity)；排名前10位的BP分別是RNA聚合酶II啟動子轉錄正調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、藥物反應(response to drug)、葡萄糖穩態(glucose homeostasis)、細胞增殖(cell proliferation)、DNA模板轉錄正調控(positive regulation of transcription，DNA-templated)、細胞增殖負調控(negative regulation of cell proliferation)、細胞增殖正調控(positive regulation of cell proliferation)、RNA聚合酶II啟動子轉錄負調控(negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、細胞對DNA損傷刺激的反應(cellular response to DNA damage stimulus)、基因表達正調控(positive regulation of gene expression)。見圖3、圖4、圖5。

圖3 CC富集條形圖

圖4 BP富集條形圖

圖5 MF富集條形圖

2.5 KEGG通路分析使用R語言軟件對32個潛在靶點進行KEGG通路富集分析，得到86條通路，并繪制了顯著性前20的通路的氣泡圖，橫坐標表示靶點數，縱坐標表示通路名稱，通路上靶點數越多顏色越紅，靶點數越少顏色越藍。涉及到磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路、人乳頭瘤病毒感染(human papillomavirus infection)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、前列腺癌(prostate cancer)、丙型肝炎(hepatitis C)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy)、癌癥蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、人類T細胞白血病病毒1感染(human T-cell leukemia virus 1 infection)、子宮內膜癌(endometrial cancer)、癌癥中心碳代謝(central carbon metabolism in cancer)、小細胞肺癌(small cell lung cancer)、胰島素抵抗(insulin resistance)、鞘脂信號通路(sphingolipid signaling pathway)、腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]信號通路、破骨細胞分化(osteoclast differentiation)、細胞凋亡(apoptosis)、發病型糖尿病(maturity onset diabetes of the young)、脂肪細胞因子信號通路(adipocytokine signaling pathway)、黑色素瘤(melanoma)等信號通路。見圖6。

圖6 KEGG富集氣泡圖

2.6 火麻仁-活性成分-靶點網絡圖的構建及分析應用Cytoscape 3.6.0軟件繪制火麻仁-活性成分-核心靶點網絡，見圖7，淡綠色代表藥物，紫色代表藥物活性成分，黃色代表靶點。連線越密集、圖形越大且顏色越深的節點越重要。

圖7 火麻仁-活性成分-靶點網絡圖

3 討論

便秘之癥首見于《黃帝內經》，將其稱之為“大便難”和“后不利”。張仲景所著《傷寒雜病論》中將該病稱之為 “脾約”。張景岳《景岳全書》將便秘分為陽結、陰結兩類。“便秘” 一名則首見于清代沈金鏊所著 《雜病源流犀燭》一書，并沿用至今[29]。從理論上來講，慢性便秘并不會提高病死率，但相關研究顯示，長期便秘者的總病死率仍高于無便秘者[30]，且對患病者的生活造成了很多不便。

火麻仁具有緩解便秘狀態、抗氧化、抑炎、調節脂代謝、抑制血小板聚集、改善記憶力、提高免疫力等藥理作用[31]。實驗研究顯示，火麻仁能夠促進大鼠膽汁的分泌，抑制小鼠胃腸蠕動和番瀉葉引起的腹瀉[32]。麻子仁片具有瀉下作用，對小鼠每天進行1次灌胃，連續灌胃4 d后，可顯著增加小鼠的排便次數[33]。慢性便秘是老年人常見的疾病，有研究發現，火麻仁富含膳食纖維(約28%)，可以有效改善老年人慢性便秘[34]。

火麻仁的活性成分中，花生四烯酸具有酯化膽固醇、增加血管彈性、降低血液黏度，調節血細胞功能等一系列生理活性。同時，花生四烯酸對預防心血管疾病、 糖尿病和腫瘤等具有重要功效。β-谷甾醇能夠以濃度依賴的方式降低結腸炎小鼠腸道組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，并顯著增加腸上皮細胞中抗菌肽的表達，降低腸道炎癥病原菌的存活率，減輕炎癥對腸道環境的干擾[35]。豆甾醇又稱豆固醇，是一種植物甾醇，廣泛存在于多種植物種子中，具有抗氧化、抗腫瘤、抗感染、降低膽固醇、保護精神狀況、鎮痛和抗糖尿病作用[36]。豆甾醇和 β-谷甾醇均可減輕脂質蓄積造成的肝細胞過氧化損傷，增強細胞的解毒功能[37]。木犀草素能夠降低平滑肌細胞AKT磷酸化水平，抑制PI3K/AKT通路激活，從而抑制平滑肌增殖[38]，還可通過減少一氧化氮產生抑制結腸平滑肌收縮，使結腸運動變得遲緩，導致便秘發生[39]。

GO分析表明，火麻仁可通過RNA聚合酶II啟動子轉錄正調控、藥物反應、葡萄糖穩態等生物過程，發揮蛋白結合、序列特異性DNA結合轉錄因子活性、鋅離子結合等分子功能。PPI結果顯示：COL1A1、PTEN、AKT1等靶點與其余靶點相互作用更強，互動更好，其中AKT1主要參與調節炎癥反應[40]，可能對腸道動力學發揮作用[41]，但目前研究較少，機制尚不明確。

綜上，火麻仁可通過多靶點、多機制改善便秘的癥狀，為臨床中醫藥治療便秘提供相應的理論依據。本研究也進一步證實，在現代網絡藥理學的背景下，中藥治病的作用機制可得到新的闡釋，進而增加中藥的科學性和實用性。但該研究并未通過相關的實驗驗證，有必要通過動物實驗進一步驗證其結果，增加結果的可信度。