完全性骶髓損傷后大鼠神經源性膀胱模型的制備與觀察

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是指由于外界直接或間接因素導致脊髓損傷。流行病學研究表明，近年來隨著社會經濟的發展，SCI的發生率在世界范圍內呈逐年上升的趨勢，其中，亞洲人脊髓損傷發病率近些年已從每百萬人12.06人的發生率上升到61.6人

。神經源性膀胱(neurogenic bladder, NB)是SCI后最常見的并發癥，以骶髓損傷為例，NB功能障礙表現為逼尿肌收縮強度或持續時間降低即逼尿肌無反射或低反射，膀胱排空時間延長或排空不能，殘余尿量增多，臨床表現為尿潴留。這種排尿困難和高壓儲尿狀態是并發膀胱-輸尿管反流、腎功能損傷等上尿路疾病的主要原因，嚴重降低了患者的生存質量

。SCI所致的NB是臨床與實驗研究的重點和熱點內容之一，然而，目前絕大多數的實驗及動物模型研究主要集中在骶上水平，選擇骶髓水平損傷的實驗及動物模型研究較少，且現有的研究造模方法不統一、缺少脊髓損傷術后的系統護理說明以及模型穩定性的判定

。因此，對脊髓骶髓水平損傷的動物模型進行系統研究就顯得十分必要。本實驗選取大鼠為實驗對象，采用脊髓完全橫斷術成功復制骶髓損傷后大鼠神經源性膀胱模型，匯報如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級健康SD雌性大鼠42只，體質量250～280g，湖南中醫藥大學動物實驗中心提供(動物許可證號：SCXK(湘)2016-0002；實驗設施實驗許可證號：SYXK(湘)2013-0005)，24～26℃的安靜環境中適應性喂養3周。適應性喂養后采用隨機數字表法編號，隨機抽取12只設為空白組，剩余30只大鼠采用改良Hassan Shaker脊髓橫斷法制作成完全性骶髓損傷后神經源性膀胱模型。實驗過程對大鼠的處置方式嚴格按照中華人民共和國科技部2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

我國企業雖然建立了股東會、董事會、監事會三權制衡的內部治理結構，但企業的產權歸國家所有，所有者地位的缺失造成企業管理當局權利的高度集中。同時，國有企業的股權比較集中，國有股一股獨大，股權過于集中容易損害非控股股東的利益，控股大股東經常操縱股東大會、董事會、監事會，且集控制權、執行權、監督權于一身，權利較大，其他股東沒有辦法來約束它。他們這些人為了少數人的利益，極有可能向外界提供虛假的會計報告。

1.2主要材料、試劑與儀器 主要材料、試劑：水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)，青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠)，4%多聚甲醛(上海威奧生物科技有限公司)，乳酸鹽林格溶液(哈藥集團制藥總廠)，橡皮生肌膏(湖南中醫藥大學第一附屬醫院自制藥)，其余常規試劑(上海國藥生物)。主要儀器：微量注射泵(浙江史密斯醫學儀器有限公司/WZ-50C6)，F3導尿管(上海康鴿)，16通道生理記錄儀(美國BIOPAC公司/MP150-WSW)，YP10002小動物電子秤(上海佑科儀表有限公司)，顯微鏡(廈門麥克奧迪)，搖床(其林貝爾)，恒溫箱(北京六一)，切片機(浙江金華益迪試驗器材)，包埋機(常州中威電子儀器)。

1.3 方法

1.3.1 手術方法 采用改良Hassan Shaker脊髓全斷法進行模型制備

，大鼠術前24h禁食不禁水，術前2h腹腔注射20U單位抗生素預防感染；隨即以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后(300mg/kg)，俯臥位捆綁固定、備皮、消毒；于L

～L

椎間隙處完全橫斷脊髓，損傷大鼠脊髓S

節段

；具體為：于鼠背部皮膚相應位置以手術刀沿后正中線作3cm的縱向切口；逐層鈍性分離筋膜、肌肉暴露L

椎體棘突及椎板，去除L

棘突和椎弓根以充分暴露脊髓，注意避免鄰近神經等組織損傷。選用5號牙科鉤平口探頭端沿椎管一側下緣穿過脊髓底部，用手術刀完全切斷脊髓，確保無神經纖維殘留。手術過程嚴格無菌操作，確認止血充分后由內而外逐層嚴密縫合創面。成模標準

：①大鼠脊髓休克期后，后肢運動功能障礙且膀胱功能障礙表現為尿潴留；②尿流動力學檢測：漏尿點壓力(leak pointpressure, LPP)降低、膀胱最大容量(maximum cystometric capacity, MCC)增加，膀胱順應性(bladder compliance，BC)增加，滿足以上即可判斷成模。剔除標準：術后存在自主排尿、尿失禁，或出現嚴重尿血、尿路感染、自噬、腹脹等并發癥的大鼠予以剔除。

圖1所示為楊莊東街4個信號交叉口路段的道路結構、道路渠化和周邊交通需求產生情況等. 從圖1中可以看出，該道路周邊聚集有大量生活社區，交通需求非常大.

1.3.2 術后護理 ①術后大籠單籠飼養大鼠，保證大鼠充分的活動空間；②予抗生素預防感染(術后1～3d，20U單位青霉素酸鈉2次/只/d；術后4～7d給予20U單位1次/只/d)；③預防電解質失衡(手術當天及第2天予大鼠乳酸鹽林格溶液皮下注射，20ml/kg，2次/d)。④予苦味酸皮膚噴噴灑預防自噬，出現自噬者及時采取創面消毒包扎處理，并予青霉素鈉預防感染。⑤腸道并發癥預防：手術當天僅予葡萄糖喂養；術后2～7d，葡萄糖加少量飼料喂養(約10g/d/只)，7d后常規喂養，出現腹脹者，減少飼料喂養并適當補充葡萄糖，溫和按揉腹部，更換大籠飼養，保證其活動范圍。⑥膀胱護理：以crede手法排尿，3次/d，避免膀胱尿液長期大量潴留膀胱造成腎、膀胱的功能損傷，若出現血尿及尿路感染等，予腹腔注射青霉素鈉(20萬u/只/d)持續治療。

1.3.3 分組處理 空白組大鼠適應性喂養后常規飼養18 d，于第19天行尿流動力學檢測，斷頸處死后剪取膀胱組織，以備HE染色后光鏡下進行形態學觀察。模型組大鼠適應性喂養后予以手術造模，造模術后每日采取規范化的術后護理，觀察并記錄大鼠膀胱殘余尿量、并發癥等情況，待第19天大鼠生命體征穩定、并發癥良好控制，將大鼠隨機分為3組，每組10只，分別于造模術后第19天、23天、28天行尿流動力學檢測，比較成模后不同階段模型大鼠的膀胱功能狀況。

1.4 評定標準

2.2.2 大鼠尿流動力學檢測結果 尿流動力學檢測結果顯示：與空白組相比較，模型組大鼠膀胱LPP降低，膀胱MCC、BC增加(

<0.01)。見表2。

1.4.2 尿流動力學檢查方法 采用膀胱造瘺法行膀胱尿流動力學檢測

：測試前將16通道生理記錄儀、F3導尿管及微量注射泵以三通管相連，確保系統密閉相通，充盈導尿管、確保管道中無氣泡影響，測試系統調零后備用。大鼠充分麻醉后固定于仰臥位，手法排除膀胱內殘余尿液后下腹部消毒備皮。于下腹正中做長約2cm的縱行切口，暴露膀胱頂，將備好的F3導管經膀胱頂造瘺處插入后以外科縫合線嚴密縫合，確保縫合嚴密后逐層縫合腹部肌肉皮膚以恢復腹腔密閉環境。打開檢測系統持續觀察，得到的穩定壓力即為膀胱的基礎內壓，之后打開微量注射泵，灌注溫生理鹽水(水溫25～35℃，速度6ml/h)

。持續記錄膀胱壓力變化曲線，并觀察膀胱最大容量、漏尿點壓力、膀胱順應性等數值：①LPP為出現首次漏尿時膀胱內壓力；②MCC為出現首次漏尿時的時灌注容積，即灌注速度(mL/min)×灌注時間(min)；③BC為膀胱容量變化值與膀胱壓力變化值相比求出大鼠膀胱順應性。

對韓城區塊3層主力煤層排采井網進行規劃，已經實施的開發井主流井距為280～350 m，南北向排距大于東西向井距的菱形井網。壓裂時通過微地震監測及穩定電場井間監測表明，壓裂縫呈橢圓狀分布，主裂縫延北東方向延伸，裂縫半長為80～175 m，在短軸方向的裂縫半長為50～85 m。壓裂井與鄰井井間距300 m以上，2口井方位垂直于最大主應力方向，壓裂基本不能波及鄰井。壓裂井、鄰井方位與主應力方向呈60°～180°，波及鄰井的幾率比較大。

2.3 造模術后第19、23、28天模型A、B、C組尿流動力學檢測結果比較 模型組大鼠行造模手術后第19天、23天、28天尿流動力學檢測結果顯示：3組間大鼠膀胱LPP、MCC及BC比較其差無統計學意義，見表3。

2 結果

空白組大鼠第19天尿流動力學檢測過程中死亡1只，模型組大鼠護理期間死亡3只，并于第23天、28天行尿流動力學檢測過程中各死亡1只，最終共計36只大鼠納入統計學分析。

2.1 實驗大鼠基本情況

2.2.1 逼尿肌組織鏡下觀察 HE染色后結果顯示，空白組大鼠膀胱逼尿肌呈正常形態結構，肌束排列緊致、肌纖維飽滿、排列整齊，間質填充少；造模術后第19天，模型組大鼠逼尿肌肌束排列紊亂、肌纖維嚴重萎縮、間質結構填充多。見圖1。結果提示：大鼠骶髓損傷后逼尿肌失神經支配，適應性地出現病理性改變。

2.1.1 一般情況 空白組大鼠一般情況良好。模型組大鼠造模術后出現雙側后肢運動功能障礙，體重減輕；術后模型組大鼠膀胱功能障礙持續表現為尿潴留，觸診下腹部可見膀胱充盈脹大，刺激腹壁(術后早期)/提尾懸空(術后晚期損傷愈合)無自主排尿。模型組大鼠行造模術后每日予3次手法排尿，4周護理期間，模型組大鼠平均單次手法排尿量、每日手法排尿總量分別為3ml及9ml左右。

新年的鐘聲已經敲響。此時此刻，我謹向全國水利系統廣大干部職工致以誠摯的問候和新年的祝福！向關心支持水利改革發展的社會各界人士表示衷心的感謝和美好的祝愿！

2.1.2 模型組大鼠并發癥發生情況 模型組大鼠死亡3只(10.00%)，血尿8只(26.67%)，自噬2只(6.67%)，腹脹2只(10.00%)，尿路感染3只(10.00%)。通過4周的系統觀察和護理，模型組大鼠18d后生命體征保持穩定，且并發癥得到良好控制。術后8d內出現并發癥的高峰期，術后13～18d出現第2個并發癥的高峰期，第2個高峰期并發癥發生較第1個高峰期減少，隨后大鼠無新增并發癥，情況穩定。見表1。

2.2 造模術后第19天模型A組大鼠逼尿肌組織與尿流動力學觀察

在這四層閱讀層次的介紹中，作者重點介紹了分析閱讀與主題閱讀的方法，這兩種層級的閱讀更具技巧性，也更讓我們獲益，我們具體來回顧一下這兩個層級的閱讀的方法和收獲。

①統計兩組患者的血糖控制效果，包括護理前和護理后的空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 hPG）和糖化血紅蛋白（HbAlc）；②統計兩組患者的并發癥發生情況，以甲亢危象、酮癥酸中毒、低血糖等并發癥發生率進行評估。

1.4.1 一般情況觀察 一般行為學觀察：記錄大鼠飲食飲水等一般情況。記錄大鼠血尿、自噬、腹脹、死亡等情況。大鼠尿量觀察、記錄：空白組、模型組大鼠提尾，觀察是否存在自主排尿的情況，觸診大鼠下腹部膀胱位置是否膨隆，存在尿潴留的表現。

1.4.3 光鏡標本制作 病理形態學觀察：蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色后，光鏡下觀察各組病理切片膀胱逼尿肌形態變化。具體操作步驟：大鼠膀胱逼尿肌標本于4%多聚甲醛中固定48h，石蠟包埋后切片于60℃下烤片1～2h，經二甲苯中脫蠟2次(10min/次)，乙醇洗蠟(100%/95%/85%/75%乙醇每級放置5min)，蒸餾水洗5min后蘇木素染5～10min，蒸餾水復洗，經PBS返藍、伊紅染3～5min、蒸餾水洗后予酒精梯度脫水(95%～100%每級5min)，二甲苯透明2次(10min/次)后中性樹膠封片，最后光鏡下觀察膀胱逼尿肌的組織形態學改變。

3 討論

SCI后的NB是脊髓損傷患者嚴重的并發癥，圍繞脊髓損傷后NB的康復研究是近年來臨床和實驗研究的熱點

。脊髓圓錐作為排尿反射的低位中樞，其受損可導致排尿反射弧中斷，逼尿肌反射消失，繼發逼尿肌的收縮能力下降，臨床表現為尿液充盈膀胱后不能正常排出，引起膀胱容積增大、順應性降低，最終表現為排尿困難、尿潴留為主要特點的神經源性膀胱功能障礙。此類膀胱儲尿和排尿功能均受到嚴重損害，殘余尿量多，尿路感染率高達83%，極易引起腎臟損害

。目前，對于脊髓損傷后NB的絕大多數的動物模型研究都集中在骶上水平，對于骶髓水平損傷的臨床及實驗研究較少。

選擇橫斷大鼠脊髓骶髓水平需要考慮到其神經控制系統及其脊髓骶段解剖位置與人體的差異性。膀胱的低級神經中樞主要為交感神經、副交感神經。其中交感神經支配膀胱頂部、頸部以及尿道，松弛逼尿肌和緊張尿道括約肌以達到貯尿目的。副交感神經興奮則膀胱逼尿肌緊張尿道括約肌放松，使尿液排出。副交感神經低級中樞位于骶段S

水平，對應大鼠椎體L

的任意部位。建立骶段完全性損傷可選擇橫斷大鼠L

椎體下的脊髓，該段受損后即可造成骶副交感神經骶-膀胱叢抑制，繼而出現逼尿肌收縮無力從而產生尿潴留

。本實驗參考相關研究選取大鼠L

椎間隙下的脊髓進行橫斷

，結果顯示：術后第18天模型組大鼠光鏡下逼尿肌肌纖維萎縮、兼間質結構填充增多、排列紊亂；尿流動力學檢測結果可見模型組大鼠膀胱漏尿點壓力顯著降低，膀胱容量、膀胱順應性增加，逼尿肌收縮無力，漏尿點壓力降低，尿液潴留，膀胱容量增大。形態學改變及尿流動力學檢測結果與相關研究結果一致，證實模型復制成功

。

脊髓損傷后的各種并發癥的發生率高，良好地控制并發癥對于保證動物模型質量十分重要。本實驗中我們觀察到大鼠后1～8d、13～18d分別出現了并發癥的高峰期，因脊髓橫斷術本身的創傷及術后脊髓休克期所致的運動系統及各內臟功能的障礙導致了第一期并發癥的高峰，之后大鼠術后創傷基本修復，部分大鼠脫離脊髓休克期，神經功能得到一定程度的恢復，并發癥發生率隨之降低。從并發癥的發生率來看，血尿和尿路感染的綜合發生率高達36.67%，占并發癥總發生率53.34%的一半以上，早期的護理方案主要采用Crede手法排尿，避免膀胱過度充盈后出現血管的破裂，本實驗中，除了規律的手法排尿之外，同時規律地控制大鼠的飲水，將二者結合起來(分三次排尿、飲水，給水約10ml/次/只)，與前期研究相比較，進一步降低了并發癥的發生率

。在脊髓休克期期間，采用常規飲食的方法，大鼠不能自主控制進食量，常因過量進食導致腹瀉、腹脹等較為嚴重的腸道并發癥，故本實驗在早期減少大鼠常規進食量，適當補充葡萄糖水以減小胃腸消化負荷，待大鼠脊髓休克期結束、運動功能提高后，逐漸恢復其常規飲食。本研究中，腸道并發癥的發生率僅為10%。

2.2.2 大小比數 大小比數被定義為胸徑大于參照樹的相鄰木占n株最近相鄰木的株數比例，用以描述林木個體大小分化程度，或樹種的生長優勢程度(描述非均一性)，其表達式 式中：Ui為參照樹i的大小比數；n為最近相鄰木的株數；kij為離散性變量，其值定義為，當參照樹i比相鄰木j大時，kij=0，否則kij=1。大小比數量化了參照樹與其相鄰木的關系，其值Ui越低，說明比參照樹大的相鄰木越少式中：U為樹種或林分平均大小比數；N為樹種或林分的林木總株數。

目前對于骶髓損傷后NB膀胱大鼠模型成功的判定并無確切的標準，骶段脊髓損傷后大鼠在脊髓休克期以及脊髓休克期后，膀胱功能障礙均表現為尿潴留狀態，客觀上為模型成功與否的判定帶來了一定的困難。采用形態學、尿流動力學等客觀的檢測方法，結合大鼠膀胱功能的表現(如：尿液潴留觸診可見膀胱脹大、大鼠提尾懸空不能自主排尿)可以準確地判斷模型成功與否。然而在實際的實驗研究中，采用尿流動力學檢測的方法需要特定的儀器，且對膀胱功能造成一定的影響，如本實驗中選用造瘺的方法行尿流動力學檢測則存在創傷較大、操作難度高、難以重復進行等局限。對此，本實驗對完全性骶髓損傷所致的大鼠NB模型進行了長達4周的系統觀察，結合膀胱功能臨床觀察、尿流動力學檢測，并總結出判斷模型成功的簡便參考標準，即：大鼠骶髓損傷術后18天度過脊髓休克期，此時觸診大鼠下腹部，若連續2天出現膀胱脹大，大鼠提尾懸空后若不能自主排尿，可以確定模型制備成功。

總之，本研究采用改良的脊髓橫斷法于大鼠第L

腰椎間隙進行橫斷，術后進行規范化的護理，較好地控制并發癥，并采用膀胱尿流動力學檢測及膀胱逼尿肌形態學觀察的方法進行驗證，成功地復制了骶髓損傷后神經源性膀胱大鼠模型，為后續的動物實驗研究提供了有益的參考。

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