雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲的毒性效應

潘厚軍 鄧美玲 古欣婷 鄭巧銀 劉雨果

(1.中國水產科學研究院珠江水產研究所,農業農村部漁用藥物創制重點實驗室,廣東省水產動物免疫技術重點實驗室,廣州 510380;2.廣東醫科大學公共衛生學院,東莞 523808)

青蒿素是中國科學家從傳統中藥青蒿中分離得到的倍半萜內酯類化合物的一種,是抗瘧疾特效藥物[1]。雙氫青蒿素是青蒿素在體內的有效活性代謝產物之一,在體外可由四氫硼鈉還原青蒿素而得到。雙氫青蒿素不僅能有效防治瘧原蟲[2],對其他寄生蟲同樣具有較好的殺滅效果[3—8]。很多寄生蟲病分布范圍廣,對人類健康和社會經濟造成巨大危害。如車輪蟲和多子小瓜蟲是引起水生動物患病和死亡的主要寄生蟲,對水生生態和養殖業造成極大的損害[8];血吸蟲能引起人獸共患的血吸蟲病,對該病的防治在公共衛生方面的重要性僅次于瘧疾[9]。由于寄生蟲離體培養困難,并且寄生蟲材料來源難以穩定獲得,因此采用與寄生蟲分類地位相近的替代模式生物,對于研究青蒿素類藥物抗寄生蟲的作用機制具有重要作用。

嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)隸屬于原生動物門纖毛亞門,可在淡水環境中營自由生活。嗜熱四膜蟲是重要的單細胞真核模式生物,遺傳背景清楚且基因組序列的數據庫完備,以其為對象在細胞學和分子生物學的研究領域取得了一系列成果[10,11]。此外嗜熱四膜蟲能在無菌液體培養基中培養,培養方法簡單,個體小且繁殖周期短。大量研究表明,嗜熱四膜蟲是研究藥物[12]、有機化合物[13]和無機物[14]等外源化學物質潛在毒性的良好模式生物。

線粒體是機體能量代謝的中心,還參與調控細胞增殖、凋亡等多種細胞活動[15]。線粒體介導的途徑在青蒿素類藥物誘導瘧原蟲細胞毒性中發揮重要作用[2]。線粒體通路途徑可通過改變線粒體膜通透性,引起線粒體膜電位降低和活性氧類增加,促進氧化應激反應從而誘導細胞凋亡或死亡[16,17]。本文利用能體外培養的嗜熱四膜蟲為試驗對象,在嗜熱四膜蟲細胞培養液中定量加入不同劑量的雙氫青蒿素,研究DHA對細胞形態、運動行為等生理方面和細胞增殖、線粒體功能、氧化還原水平等生化方面的影響,探討DHA對嗜熱四膜蟲的毒性作用,為評估青蒿素類藥物在抗蟲方面潛在的藥用價值提供基礎數據和科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

嗜熱四膜蟲(B2086.2株由美國康奈爾大學贈送)蟲種以5% 的體積分數接種于裝有5 mL Neff培養液(0.25% 蛋白胨、0.25% 酵母提取物、0.5%葡萄糖和 9 g/L的FeCl3母液按0.1% 體積比加入)的試管中,于30℃、150 r/min 搖床培養48h后,將處于對數生長期時的嗜熱四膜蟲蟲液轉移擴大培養。

雙氫青蒿素的配制:0.1 g DHA(99.9%,中國食品藥品檢定研究院)用少量二甲基亞砜(DMSO)溶解,配制成0.2 mol/L DHA儲備液,使用時用適量培養液稀釋至實驗所需濃度。

1.2 CCK8法檢測細胞增殖活力

采用CCK8法測定雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲細胞增殖的影響。移取對數生長期的嗜熱四膜蟲按1×104個細胞/mL接種于10 mL新鮮培養液中。根據預實驗結果,設置DHA暴露組(濃度分別為40、80、160和320 μmol/L),陰性對照組(0.01% DMSO)和空白對照組(無蟲體的培養液),在30℃、150 r/min條件下搖床培養24h、48h和72h。吸取100 μL至96孔板,參考CCK8試劑盒(CK04-500T,東仁化學科技上海有限公司)說明書所述方法,用酶標儀(800TS,美國伯騰儀器有限公司)于450 nm處測定吸光度(A)值。細胞增殖活力(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100%(其中A1、A2和A0分別為實驗組、陰性對照組和空白組的A值)。每個濃度設4個復孔,實驗重復3次。

1.3 嗜熱四膜蟲細胞形態觀察

移取對數生長期的嗜熱四膜蟲按1×104個細胞/mL接種于10 mL新鮮培養液中。設置DHA暴露組(濃度分別為40、80、160和320 μmol/L)和對照組(0.01% DMSO)。于30℃、150 r/min 搖床培養48h。各組分別取200 μL依次加入24孔板中,倒置顯微鏡(Ti-S,日本Nikon公司)下觀察細胞數目,形態和運動狀況。為了進一步觀察細胞凋亡特征,于培養48h 后,3200 r/min離心5min收集細胞,棄上清。加沉淀2—3倍體積的Hoechst 33258染色液(C1017,上海碧云天生物技術有限公司),室溫避光培養20min,3200 r/min離心5min棄染液。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH 7.4)洗2次,取20 μL細胞懸液滴在載玻片上,加入抗熒光淬滅封片液(P0126,上海碧云天生物技術有限公司)。熒光顯微鏡(X73,日本Olympus公司)下觀察細胞核形態。

1.4 線粒體膜電位分析

細胞培養和實驗分組同1.3。取DHA處理48h后的細胞,經自動細胞計數儀計數,收集4×104個細胞。按 JC-1試劑盒(C2006,上海碧云天生物技術有限公司)使用說明書要求操作,配置JC-1工作液及JC-1緩沖液(使用前稀釋至1×),四膜蟲細胞置于JC-1工作液,37℃ 染色20min,離心取上清,加JC-1緩沖液重懸離心,重復洗滌2次后用適量JC-1緩沖液重懸細胞,流式細胞儀(FACSCanto Ⅱ,美國BD公司)檢測,分別采集紅色熒光(激發波長525 nm,發射波長585 nm)和綠色熒光(激發波長490 nm,發射波長 530 nm)下的圖像。橫坐標為熒光強度,縱坐標為細胞數量,以紅/綠熒光強度比值表示線粒體膜電位。實驗重復3次。

1.5 嗜熱四膜蟲抗氧化酶活力

細胞培養和實驗分組同1.3。取DHA處理48h后的細胞,以3200 r/min離心5min收集細胞,棄上清。用生理鹽水洗2次后加入一定量的PBS使細胞重新懸浮,經液氮反復凍融使細胞裂解。將細胞懸液在4℃ 3200 r/min離心5min,取上清液待測。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)和琥珀酸脫氫酶(SDH)測定均采用南京建成生物工程研究所研制試劑盒,按照相關說明書操作經分光光度計測定。

1.6 統計學分析

實驗數據用平均值±標準差(mean±SD)表示,采用 SPSS 13.0 軟件進行統計處理分析。單因素方差分析(One way ANOVA)檢驗組間是否存在顯著性差異,如果存在顯著性差異,通過Tukey分析法進行多重比較,顯著性差異水平采用P＜0.05。

2 結果

2.1 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲細胞增殖的影響

DHA作用嗜熱四膜蟲24h、48h和72h后,采用CCK-8法檢測各濃度組、各時間點細胞增殖情況(圖1)。隨著濃度增加,嗜熱四膜蟲細胞增殖活力下降,與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。24h下,40與80 μmol/L組,80與160 μmol/L組的差異沒有統計學意義。在48h和72h下各時間點組兩兩比較差異有統計學意義(P＜0.05),表現為增殖活力與濃度呈負相關。在相同DHA作用濃度下,細胞增殖隨著時間增加表現為逐漸降低,72h時細胞增殖活力最低。根據實驗結果,選取DHA暴露48h作為時間樣點進行后續試驗。

圖1 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲細胞增殖的影響Fig.1 The effect of DHA on the proliferation of Tetrahymena thermophila

2.2 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲形態及運動的影響

倒置顯微鏡下觀察結果見圖 2,對照組嗜熱四膜蟲細胞呈橢圓長梨狀,細胞數目多,活動速度快。DHA作用下各濃度組嗜熱四膜蟲形態發生改變,細胞皺縮變圓,胞質內空泡明顯;同時隨著濃度增大,細胞生長明顯受到抑制,活動速度逐漸減慢。與對照組比較,160和320 μmol/L濃度組DHA處理細胞可見數量明顯減少,出現細胞破裂和異常細胞形態。

圖2 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲形態的影響 (比例尺=20 μm)Fig.2 The effect of dihydroartemisinin on morphology of Tetrahymena thermophila (Scale bar=20 μm)

Hoechst 33258核染色結果見圖 3。與對照組比較,40和80 μmol/L濃度組DHA處理后細胞核形態沒有發生明顯變化。160和320 μmol/L濃度組DHA處理后,細胞核呈濃染致密的顆粒狀熒光,且胞核固縮變小,并出現凋亡小體(圖3箭頭指示)。

2.3 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲線粒體膜電位水平的影響

圖4中的細胞散點圖所示,對照組細胞集中在左下區,紅色熒光強,線粒體膜電位高。隨著DHA濃度的增加,綠色熒光強度增加,右下區細胞逐漸增多。對照組與40、80、160和320 μmol/L DHA實驗組的紅/綠熒光比值分別為(1.13±0.28)、(0.93±0.13)、(0.93±0.27)、(0.14±0.18)和(0.12±0.31)。與對照組相比,160和320 μmol/L濃度組DHA處理后細胞的紅/綠熒光比值顯著升高,差異有統計學意義(P＜0.05)。這說明在一定濃度下雙氫青蒿素可使嗜熱四膜蟲細胞線粒體膜電位下降。

圖4 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲細胞線粒體膜電位的影響Fig.4 The effect of dihydroartemisinin on mitochondrial membrane potential of Tetrahymena thermophila

2.4 雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲酶活力的影響

不同濃度DHA作用嗜熱四膜蟲后,其抗氧化酶活力和SDH水平見表 1。在40、80和160 μmol/L DHA作用下,細胞內抗氧化酶SOD、GSH-Px、GST和CAT活性明顯高于對照組(P＜0.05),320 μmol/L DHA作用下細胞內抗氧化酶SOD、GSH-PX活性明顯低于對照組(P＜0.05),GST和CAT活性與對照組相比無顯著性差異。隨著DHA濃度增加,抗氧化酶活力呈先升高后降低的趨勢。DHA作用下各濃度組與對照組相比,琥珀酸脫氫酶活力均顯著降低(P＜0.05)。

表1 雙氫青蒿素作用對嗜熱四膜蟲SOD、GSH-PX、GST、CAT和SDH活力的影響Tab.1 The effect of dihydroartemisinin on enzyme activities in Tetrahymena thermophila (mean±SD,n=3;U/mg Prot)

3 討論

DHA 是青蒿素的衍生物,最先用于治療瘧疾,同時也具有抗腫瘤、抑菌殺蟲和免疫調節的功用。關于DHA抗寄生蟲作用的研究,發現DHA通過破壞原蟲表膜-線粒體系統[3]來抑制伯氏瘧原蟲的生長;通過對毛蟲滋養體的蛋白質及細胞骨架的損傷作用,來抑制藍氏賈第鞭毛蟲的生長[4];此外DHA 能破壞卡氏肺孢子蟲滋養體和包囊[5]、蟲膜系結構[6]而起到殺蟲作用。伴隨抗寄生蟲藥物耐藥性挑戰,雙氫青蒿素有望成為抗寄生蟲新藥,但其殺蟲機制尚待進一步闡明。因此我們采用能體外培養的嗜熱四膜蟲來研究雙氫青蒿素的抗蟲作用機制。本實驗首先觀察雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲增殖和形態的影響,結果顯示與對照組相比,DHA作用下細胞增殖受到抑制,細胞形態改變且運動速度減慢。研究表明青蒿琥脂、雙氫青蒿素對嗜熱四膜蟲生長代謝有抑制作用,但雙氫青蒿素的抑制作用強于青蒿琥脂[18],這可能與兩者的構效不同有關。

當生物體暴露于外界毒物時,抗氧化防御系統會構成機體的第一道防線,抗氧化酶活力的改變可反映機體的氧化應激水平。關于外源化學物質對嗜熱四膜蟲生物脅迫作用的研究顯示,H2O2處理后細胞線粒體膜電位喪失,發生凋亡樣死亡[19]。有機紫外防曬劑[20]和納米材料[21]均可誘導嗜熱四膜蟲產生氧化應激,導致抗氧化物質如SOD和GST等活力降低。在本研究中,DHA在40、80和160 μmol/L濃度下誘導細胞內抗氧化酶升高,說明嗜熱四膜蟲表現出氧化應激。隨著DHA濃度升高至320 μmol/L,抗氧化酶水平降低。推測中低濃度DHA暴露下機體抗氧化防御酶活性增強以減輕DHA對細胞造成的氧化脅迫,而高濃度DHA暴露下細胞內氧化損傷加重導致細胞活力降低,進而破壞抗氧化酶導致酶水平降低。Ye等[12]研究發現,高濃度鉤吻素子(中藥斷腸草中的活性成分)作用嗜熱四膜蟲可引起氧化應激和凋亡,低濃度下脅迫作用不明顯。這與本實驗結果存在一定差異,不同化學物質對嗜熱四膜蟲的毒性大小有所區別,因此細胞對氧化應激的適應性響應不同。

線粒體膜電位的穩定有利于維持細胞的正常生理功能[22]。有研究表明青蒿素在快速殺滅寄生蟲過程中線粒體膜電位下降是主要生理事件,而膜電位下降又與氧化應激催化生成的活性氧(ROS)有關[23]。琥珀酸脫氫酶參與線粒體能量代謝,是反映線粒體功能的標志酶[24]。本實驗結果顯示,一定濃度的DHA(160和320 μmol/L)暴露可降低嗜熱四膜蟲線粒體膜電位和琥珀酸脫氫酶活力(P＜0.05),這表明DHA暴露可造成線粒體功能損傷。在神經元細胞中也發現線粒體跨膜電位下降是蒿甲醚引起神經毒性的重要環節[25]。本實驗結果與上述研究有相似之處,青蒿素類藥物對細胞的毒性作用可能與線粒體損傷有關[26]。結合Hoechst染色結果,包括細胞核出現濃縮和染色體凝集等典型凋亡形態學改變,故推測DHA暴露導致氧化應激,引起活性氧過度堆積,造成線粒體損傷,最終誘導細胞凋亡。然而考慮到線粒體通路產生復雜的細胞傳導通路和級聯反應,雙氫青蒿素抗嗜熱四膜蟲的機制有待進一步研究。本研究現有結果表明DHA對嗜熱四膜蟲具有毒性效應,氧化應激和線粒體損傷可能是毒性作用途徑。