貴州省浮萍形態學鑒定與遺傳多樣性分析

馮丹 譚艾娟 呂世明 鄭萌盟 楊貴利,

(1.貴州大學生命科學學院,山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室,山地生態與農業生物工程協同創新中心,貴陽 550025;2.貴州大學動物科學學院,貴陽 550025;3.中國科學院地球化學研究所環境地球化學國家重點實驗室,貴陽 550025)

浮萍,屬于被子植物門,單子葉植物綱,共有5個屬,分別是綠萍屬(Lemna)、紫萍屬(Spirodela)、斑萍屬/蘭氏萍屬(Landoltia)、泥萍屬(Wolffiella)和無根萍屬/蕪萍屬(Wolffia)[1]。浮萍是世界上最小的開花植物,植株較小,只有幾到幾十毫米。浮萍結構比較簡單,僅有葉狀體和根,通常漂浮于水面,通過葉狀體或根從水中吸收營養物質[2];浮萍通常以無性繁殖的方式生長,從母葉狀體無性生殖出子葉狀體,繁殖速率近似指數增長,生長周期短至1—2d即可實現生物量翻倍。浮萍在溫度較低時會產生休眠體進入休眠狀態,如越冬前在其夾囊或開口內生橢圓形的冬芽,脫離母體沉入水底,第2年當溫度回升時浮出水面形成新的植株重新生長,生命力極強[3,4];浮萍可以在pH 4.5—7.2,溫度為2—35℃的條件下生長,具有較寬的pH和溫度域,對自然環境的適應能力強,所以浮萍分布廣泛,在世界各地的水田、池沼和湖泊等靜水中均有分布[5]。

近年來,浮萍以其獨有的優勢逐漸引起關注,已被廣泛應用于生物燃料、毒性測試、環境監測和污水修復等方面[6,7]。浮萍能克服藻類的缺點,利用生長抑制試驗評價污染物質的毒性,可以更好、更標準地反映廢水毒性的變化[8,9],同時也是地表水中污染物(有機污染物、重金屬、農藥、放射性廢物、納米材料和碳氫化合物)的有效生物蓄積器[10,12]。其次,浮萍作為新型生物反應器可以用于合成疫苗、抗體、藥用蛋白和工業酶制劑等生物制品,在生物制藥方面也表現出了巨大的應用潛力[13]。目前,利用轉基因浮萍表達抗體已有研究報道[14],例如Cox等[15]在Lemna minor中成功表達了單克隆抗體(Monoclonal antibody,mAb),Khvatkov等[16]在Wolffia arrhiz中成功表達了粒細胞集落刺激因子(Gh-CSF),以上結果為開發以浮萍為生物反應器合成抗體、蛋白等生物制品提供了依據。有研究表明[17]L.minor在液體培養基中生長速度快(生物量倍增時間為36h),蛋白質含量高達其生物量干重的45%。2017年,Appenroth等[18]報道指出浮萍中的蛋白質和氨基酸含量與世界衛生組織(WHO)推薦給人類的價值幾乎相同,證實浮萍也是一種潛在的蛋白質來源[19]。此外,在光照條件為110 μmol/(m2·s)時,Lemna aequinoctialis的最大淀粉產量為98.70 g/m2,說明浮萍是生產丁醇和乙醇等最有希望的替代能源之一[20—23]。所以,浮萍是一種極具應用前景的小型水生被子植物,是一種適用于基礎和應用研究的新型生物材料。

隨著現代生物科學技術的成熟,研究遺傳多樣性的方法由最初的形態學水平發展到細胞水平,再進一步發展到生物化學和分子生物學水平,利用分子生物學技術開展浮萍的研究也越來越多[24]。浮萍有5個屬37個種,其遺傳多樣性能夠影響其表型特征和其他生物性狀,從而導致浮萍對不同自然環境的適應性不同[25]。遺傳多樣性是物種進化潛能和適應自然界生存壓力的重要遺傳學評價指標,對于不同地區的浮萍進行種屬鑒定,分析其種質資源的分布情況,發現不同水域、溫度和地形均對浮萍的多樣性有影響[26]。因此,對浮萍科植物進行遺傳多樣性分析能對不同地區浮萍科植物的研究提供遺傳性依據。2009年,Martirosian等[27]對25份浮萍科植物種質的rpS16內含子序列分析表明,基于rpS16內含子的遺傳距離分析支持將Landoltia punctata從紫萍屬分離出來單獨設立斑萍屬。隨后,Wang等[28]比較了CBOL (Consortium for the Barcode of Life)提出的7個質體標記對97份浮萍科31種植物的序列識別潛力,最后發現atpF-atpH間隔序列最能表現浮萍多樣性的特點,建立了基于該序列多態性的浮萍分子鑒定方法。所以,atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子序列都可用于浮萍系統發育研究,且同時利用atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子序列共同鑒定浮萍科植物的種屬準確性更高。因此,為了更準確地區分貴州省浮萍科植物種間遺傳多樣性,需要同時利用atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子對浮萍不同株系進行種屬鑒定[29]。

本研究在貴州省轄9個地級行政區的多處水環境中共采集到41份浮萍種質,利用葉綠體atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子序列進行分子生物學分析,并對浮萍遺傳多樣性分析進行初步性研究,討論并比較了中國亞熱帶濕潤季風地區浮萍種群和遺傳多樣性的差異。對浮萍進行形態學鑒定和遺傳多樣性分析無論是對浮萍多樣性的保護,還是對浮萍物種的生物學理解和生物量生產應用都有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料采集

貴州省地處中國西南內陸地區腹地,跨長江和珠江兩大水系,界于北緯24°37′—29°13′,東經103°36′—109°35′;貴州境內地勢西高東低,海拔在157—2841 m,屬亞熱帶濕潤季風氣候,氣候溫和,雨量充沛,年平均日照1354h,年均溫度18℃左右,夏季平均氣溫24℃,年均降雨量1200 mm[30]。貴州省野生植物資源豐度很高,共計43科75屬126種[31]。浮萍作為一種適應能力強的植物,在貴州省也廣泛分布,本研究在貴州省9個地級行政區采集到多種浮萍資源,共計41份 (圖1)。

圖1 貴州省浮萍種質采集地點分布Fig.1 Distribution of duckweed germplasm collection sites in Guizhou Province

1.2 儀器藥品

試劑:NaClO、75%乙醇、MS培養基(Hopebio;青島)、頭孢霉素(Ameresco;USA)、Hoagland培養液、巰基乙醇(Aladdin;上海)、CTAB、核酸提取液(Acmec;上海)、異丙醇(Aladdin;上海)、Taq酶(TransTaqDNA Polymerase High Fidelity;北京)、瓊脂糖(Sigma-Aldrich;USA)。

儀器:體視顯微鏡(SMZ-171;Motic;廈門)、人工氣候培養箱(GXZ-80;Thermo;美國)、超凈臺(SW-CJ-1D;孚夏;浙江)、滅菌鍋(DR60DA;ZEALWAY;USA)、pH儀(pHS-3C;雷磁;上海)、通風櫥、離心機(TG-16S;蜀科;四川)、T100 Thermal Cycler PCR儀(T100;Thermo;USA)、水平電泳儀(JY1600C;JUNYI;北京)、凝膠電泳成像儀 (biorad ChemiDoc MP;Bio-Rad;USA) 。

1.3 無菌株系的制備

將野外采集的浮萍材料編號,純水中漂洗兩遍,采用5%的次氯酸鈉和75%的乙醇進行外植體消毒處理并接種于添加50 mg/L頭孢霉素的MS固體培養基中進行保存,繼代周期為1個月,為后續實驗提供種質資源材料。DNA提取前,從保存的培養皿上接種10—20片浮萍植株轉接至pH調至5.0—5.5,添加1.5%蔗糖后滅菌處理的Hoagland營養培養液中進行擴大培養[32],培養條件為光照強度5000 lx,溫度25℃,光照周期16h/8h(L/D),濕度75%,培養時間2周左右。

1.4 形態學鑒定

用體視顯微鏡對無菌培養的浮萍進行形態學鑒定,通過根的數量、葉片的大小、顏色等形態,粗略鑒定浮萍樣品的屬分類。在浮萍5屬中,泥萍屬(Wolffiella)未在國內發現,無根萍屬/蕪萍屬(Wolffia)體積較小,無根,呈微小顆粒狀,易與其他屬區分開,綠萍屬(Lemna)、紫萍屬(Spirodela)和斑萍屬/蘭氏萍屬(Landoltia)都有葉狀體和根,很少開花,常在葉狀體邊緣的側囊中形成子代葉狀體,子代葉狀體逐漸長大從側囊中浮出。根據葉片和根的形態觀察判斷標準如下:正面背面均為綠色,葉片小,長倒卵形或橢圓形,表面積約1—25 mm2,表面中脈稍隆起,腹面扁平,由1—4片單一的葉狀體組成,每個葉狀體有1根細長的根,根鞘短,植物體開花時,著生花器的2—3個葉狀體脫離母體浮出水面,屬于綠萍屬(Lemna);葉片表面積與綠萍屬相似,呈倒卵形,正面中央為綠色,葉脈5條以下,邊緣一圈紫色,背面為紫色,根較少的浮萍屬于斑萍屬/蘭氏萍屬(Landoltia);葉片較大,圓形或倒卵形,不對稱,葉狀體腹面凸起,表面積約1 cm2,葉脈5條以上,正面呈綠色,背面為紫色,根非常茂密且長,15—35 mm,根冠明顯,屬于紫萍屬(Spirodela)[33—35]。

1.5 DNA提取、PCR擴增及測序

使用CTAB法提取浮萍DNA,取0.1—0.5 g新鮮浮萍葉片與于1.5 mL離心管中,加入1 mL含有2 μL的2×CTAB,65℃水浴30min,期間不斷搖動,使之混勻;水浴后冷卻到室溫,加入等體積的核酸提取液,混勻,12000 r/min離心10min;取上清液重復上述動作一次;取上清液于新的1.5 mL離心管,加入0.6倍體積冰浴的異丙醇,在-20 ℃冰箱放置30min后,12000 r/min,4 ℃離心10min;取上清液,在沉淀中加入1 mL 75%的乙醇,12000 r/min,4℃離心5min,吸去乙醇;在超凈臺吹干沉淀,加入30—50 μL ddH2O,溶解DNA,置于-20℃保存。

PCR擴增浮萍的葉綠體atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子序列(引物見表 1)。反應體系25 μL:2 μL的DNA 模板,0.25 μL 5 U/μL HiFi酶,2.5 μL 10×Trans TaqHiFi buffer,2 μL 2.5 mmol/L的dNTP,1 μL引物,17.25 μL的ddH2O。PCR擴增反應程序:95℃預熱變性5min,94℃變性30s,50℃降溫30s,72℃延伸45s,30個循環,72℃延伸2min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,產物由擎科公司測序。

表1 atpF-atpH和rpS16序列擴增引物Tab.1 Primers for the amplification of atpF-atpH and rpS16

1.6 分子系統學及遺傳多樣性分析

在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數據庫中下載已知的37種浮萍物種的代表性序列,先用BioDeit軟件進行序列比對和剪切,再分別采用atpF-atpH間隔序列與rpS16內含子序列在Mega6.0軟件中構建NJ(Neighbor-joining Tree)型系統發育樹,確定浮萍樣品的種屬分類,再將浮萍所有樣品序列比對結果輸入DNA SP6軟件,分析貴州省不同地區浮萍種質資源的遺傳多樣性,包括單倍型數(H)、單倍型多態性指數(Hd)、核苷酸多態性指數(Pi)、群體突變率(θw)和平均每kb核苷酸差異數[36]。

2 結果與討論

2.1 形態學鑒定

通過肉眼及顯微鏡對浮萍葉狀體和根進行觀察,鑒定貴州省采集的41份種質中只有綠萍屬(Lemna)、紫萍屬(Spirodela)和斑萍屬/蘭氏萍屬(Landoltia)。其中綠萍屬居多,共33個;其余有6個紫萍屬,2個斑萍屬(表2和圖 2)。貴陽市位于貴州省中部,水資源豐富,主要采集的浮萍為綠萍屬和斑萍屬,只有1株紫萍屬;安順市位于貴州中部偏西,只采到綠萍屬,沒有采到紫萍屬和斑萍屬;黔東南和黔北地區的遵義和銅仁市多有綠萍屬和紫萍屬,約70%為綠萍屬,黔西地區包括六盤水和畢節等市,主要采集到的是綠萍屬和斑萍屬,畢節市只采到綠萍屬,六盤水采到綠萍屬和斑萍屬。

圖2 浮萍代表性株系的形態學觀察Fig.2 Morphological observation of representative strains of Duckweed

表2 浮萍種質的形態學鑒定Tab.2 Morphological identification of duckweed germplasm

2.2 葉綠體保守序列PCR擴增

圖3是部分浮萍株系的atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子序列PCR擴增結果。其41個種質都成功擴增出目的條帶,其中atpF-atpH間隔序列的長度為 687—708 bp,rpS16內含子序列的長度為1020—1059 bp 。

圖3 部分浮萍種質atpF-atpH間隔序列和rpS16間隔序列凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of atpF-atpH interval sequence and rpS16 interval sequence of some duckweed germplasm

2.3 分子生物學鑒定結果

利用浮萍葉綠體atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子序列進行分子聚類分析,41份浮萍種質聚類到4個種,分別是L.aequinoctialis、L.minor、Spirodela polyrhiza和Landoltia punctata。用兩種序列所得出的結果吻合,在屬間的分類與形態學分類的結果一致。其中L.minor種質數量最多,有29份,4份屬于L.aequinoctialis,6份屬于S.polyrhiza,2份屬于L.punctata(表3)。

利用atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子序列分別用BioDeit軟件比對后,用MAGE6軟件構建分子系統發育樹(圖4)。

從NCBI上下載了浮萍37個種的葉綠體atpF-atpH間隔序列,并按照全部序列中最短的序列進行剪切,構建的系統發育樹親緣關系更準確;同樣,在NCBI上下載25條浮萍rpS16內含子序列,其中,綠萍有7個未找到,無根萍有1個未找到,蕪萍屬有4個未找到,本次在貴州省內的樣品采集過程中沒有以上浮萍種,所以對實驗分析結果的影響不大。

由發育樹圖 4a可看出,0168所代表的29份浮萍種質由atpF-atpH間隔序列所構成的系統發育樹都與L.minor聚為一類,因此,這29份種質為L.minor,0145、0080、0083和0180與L.aequinoctialis聚為一類,以0079為代表的6份種質與S.polyrhiza聚為一類,0169、0174與L.punctata聚為一類;此結果與圖 4b相對比,聚類結果相同。將41份浮種質分類進行總結(表3)。

圖4 貴州41份浮萍種質的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 41 Duckweed germplasm in Guizhou Province

表3 貴州省41份浮萍種質的分類Tab.3 Classification of 43 duckweed germplasm in Guizhou Province

2.4 遺傳多樣性分析

利用DNA SP6軟件分析貴州省浮萍種質的遺傳多樣性。結果表明貴州省浮萍種質的遺傳多樣性非常豐富,基于atpF-atpH和rpS16的單倍型指數分別為13和10,群體突變率分別為0.15380和0.14334,核苷酸多態性指數分別為0.08725和0.09158,每kb平均核苷酸差異數為47.20000和61.72200,單倍型多態性指數分別為0.98700和0.64700(表4)。

表4 貴州省浮萍遺傳多樣性分析Tab.4 Genetic diversity analysis of duckweed in Guizhou Province

不同屬間遺傳多樣性也存在差異,綠萍屬基于atpF-atpH的單倍型指數遠大于rpS16序列的單倍型指數,多根紫萍屬和少根紫萍屬單倍型數分別為5和1,綠萍屬平均每kb核苷酸差異數及核苷酸多態性指數最大,其次是紫萍屬;群體突變率也是綠萍屬最大,其次是紫萍屬,斑萍屬群體突變率及核苷酸多態性均最小(表5)。

表5 不同屬浮萍遺傳多樣性分析Tab.5 Genetic diversity analysis of duckweed in different genera

3 討論

3.1 貴州省浮萍種質資源分布

貴州省分為黔中、黔西、黔北、黔東南等幾個地區,黔中地區包括貴陽、安順等市,屬于以山地、丘陵為主的丘原盆地地區,最高溫度平均在25—28℃[37],水資源豐富,綠萍屬分布較多;黔北地區的遵義和銅仁市多有綠萍屬和紫萍屬,遵義市處于云貴高原向湖南丘陵和四川盆地過渡的斜坡地帶,在云貴高原的東北部,地形起伏大[38],主要分布綠萍屬,銅仁市在遠離河谷的山原面上,巖溶、丘陵、洼地較多,地面起伏不太大,主要分布綠萍屬和紫萍屬;黔東南山地縱橫,峰巒連綿,群山疊翠、林木蔥籠,森林資源豐富,年平均氣溫15℃左右,在黔東南地區只采集到綠萍屬;黔西地區包括六盤水、畢節等市,主要分布綠萍屬和斑萍屬,畢節市地處滇東高原向黔中山原丘陵過渡的傾斜地帶,平均溫度10—15℃[39],只采集到綠萍屬,六盤水市地處長江水系和珠江水系的分水嶺地區,境內10 km以上河流43條,水資源豐富,采集到綠萍屬和斑萍屬。因此可以看出,紫萍屬多在地勢起伏不大,溫度較高的地區有分布;斑萍屬在溫度為25℃左右、水資源豐富的地區分布較多,綠萍屬適應能力更強,溫度適應域較寬,10—25℃均能生長,對自然環境的適應能力較強,分布最廣;此外,貴州省屬于喀斯特地貌,全省地貌可概括分為高原、山地、丘陵和盆地四種基本類型,其中92.5%的面積為山地和丘陵,水域分布不均勻,由于某些人為原因(比如使用除草劑或人工清理等)使浮萍科植物生長的池塘、稻田等水域未采集到浮萍,雖然采樣地分布較集中,但是在貴州省9個地級行政區都進行了采集,并且常見的綠萍屬、紫萍屬、斑萍屬都有采集到。因此,對研究浮萍科植物在貴州省的分布及遺傳多樣性分析均無較大影響。

3.2 貴州省浮萍種質資源鑒定

經構建系統發育樹分析發現,貴州省41份浮萍種質,經過聚類分析得到3屬4種,分別是L.aequinoctialis、L.minor、S.polyrhiza和L.punctata,其中L.minor分布最多。浮萍科植物有5個屬37種,而相關研究發現除泥萍屬(Wolffiella)從未在國內找到以外,中國浮萍科植物只有4屬[40]。在海南島收集到34個浮萍株系,經過鑒定共有4屬4種,分別是Wolffia globosa、L.aequinoctialis、S.Polyrrhiza和L.punctata[41];太湖流域采集到3屬5種浮萍,分別為S.polyrrhiza、L.minor、Lemna turionifera、L.aequinoctialis和L.punctata[42];2018年,陳蕾等[43]在廣東和江蘇2省采集了63份浮萍樣品,結果為3屬4種,L.aequinoctialis、L.minor、S.polyrhiza和L.punctata,其中廣東采集的浮萍均為L.minor;江西省10個市29個縣(區)采集到39份浮萍種質,經過種屬鑒定,共有4屬5種,分別為L.minor、Lemna perpusilla、S.polyrrhiza、L.punctata和Wolffia arrhiza,L.minor最多共34株[44]。目前,中國長江中游的湖北、湖南,下游地區的江西一帶,包括東邊的浙江和福建,南邊的廣東,東北方向的江蘇及華南地區的海南等8個省份的浮萍種質資源研究取得較大進展。而貴州省位于中國西南喀斯特地區的中心區域,喀斯特地貌發育強烈,地形起伏大,濕潤溫暖,光照充足,多年年均降水量約為1142 mm,年均氣溫16℃[45,46],氣候及水資源均是浮萍科植物生長的良好環境,尚未有關于浮萍分布及遺傳多樣性的研究,因此,本實驗采集了貴州省41份浮萍種質,經過聚類分析得到3屬4種,其中L.minor是優勢種,在亞熱帶濕潤季風氣候地區,熱量豐富、雨量充沛、光照充足,非常適合浮萍科植物的生長,但是不同屬之間對水體環境的適應能力不同,綠萍屬在不同水域中均有分布,而紫萍屬和斑萍屬多在地勢起伏不大、溫度較高、水資源豐富的地區分布,貴州省浮萍種質資源豐富,并且積累了較多的遺傳多樣性。

3.3 貴州省浮萍遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分,是地球上所有生物攜帶的遺傳信息的總和。已有研究發現atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子序列保守性很高,最能體現浮萍多樣性的特點[47],因此,本研究對貴州省41個浮萍樣品DNA 序列進行遺傳多樣性分析,利用atpF-atpH間隔序列和rpS16內含子序列共同鑒定浮萍科植物的種屬準確性更高,其中主要分析群體突變率(θw)、平均核苷酸差異數(kb)、單倍型多態性指數(Hd)和核苷酸多態性指數(Pi)。目前,國內只有吉林省、長江中游湖南、湖北地區和福建地區對浮萍科植物遺傳多樣性進行了研究[48],與典型亞熱帶季風氣候地區對比,貴州省浮萍科植物的群體突變率均較大,綠萍屬和紫萍屬基于atpFatpH間隔序列和rpS16內含子序列的每kb平均核苷酸差異數和核苷酸多態性指數均遠大于湖南、湖北地區,福建地區和典型溫帶季風地區吉林省均未找到斑萍屬,貴州省綠萍屬和紫萍屬遺傳多樣性也均大于福建省和吉林省的浮萍科植物多樣性。由此可見:貴州省浮萍種質存在豐富的遺傳多樣性?？λ固氐貐^亞熱帶濕潤季風氣候高溫多雨,全年溫潤,使浮萍科植物積累了較多的遺傳多樣性。因此貴州省浮萍科植物的遺傳多樣性豐富。

本研究以貴州省為代表對亞熱帶濕潤季風氣候喀斯特地區浮萍科植物進行種屬鑒定和遺傳多樣性分析,比較了浮萍種間親緣關系及變異情況,為浮萍種屬鑒定和親緣關系分析提供依據,有利于對亞熱帶濕潤季風氣候地區浮萍科植物的研究。