基于線粒體COⅠ基因的9個青魚群體遺傳變異分析

鮑生成 包天杰 王沈同 徐曉雁, 代雅凡 張家華 李家樂, 沈玉幫,

(1.上海海洋大學農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室,上海 201306;2.上海海洋大學上海水產養殖工程技術研究中心,上海 201306)

青魚(Mylopharyngodon piceus)肉味鮮美、生長快,且具有較高的營養價值,是我國四大家魚之一,在我國的珠江到長江、黑龍江都有分布,且在全國各地廣泛養殖。但是近些年由于生態環境的破壞,我國青魚的野生群體量嚴重下降[1,2],使得推進青魚種質資源遺傳多樣性調查和研究工作尤為重要。線粒體DNA分子結構簡單,可以自我復制,不易發生基因重組,進化速率較快。目前為止,已經廣泛被應用到魚類種群的遺傳結構研究中,且青魚的遺傳進化研究中也有了一定的基礎。

付曉艷等[3]最早于2004年對長江和珠江水系4個不同地點54尾青魚樣本的線粒體Cytb基因遺傳多樣性進行了分析,發現4個群體的遺傳分化程度和遺傳多樣性水平都較低。謝啟明等[4]運用線粒體Cytb基因與D-loop區兩種分子標記分析了3個青魚養殖群體的遺傳結構,結果發現群體間遺傳多樣性較豐富,出現了高度分化,基因交流明顯,且受到純化選擇作用。楊宗英等[5]基于mtDNA序列分析了長江中游5個野生青魚群體的遺傳結構,發現青魚群體可能經歷過種群擴張事件且各青魚群體間遺傳分化不明顯。王豐等[6,7]使用自主開發的12個微衛星標記分析了4個野生群體及1個養殖群體青魚的遺傳結構,發現5個群體具有較高的遺傳多樣性,養殖群體與4個野生群體遺傳距離較遠。

對青魚遺傳結構的了解是保護種質資源的前提條件。當前以對于線粒體DNA開展青魚的遺傳多樣性研究,主要是以D-loop區、Cytb基因為主,目前尚且沒有以線粒體COⅠ基因為分子標記分析青魚遺傳結構的研究。本研究采用COⅠ基因為研究區域,通過測序對9個地理群體共271個樣本進行研究,目的是通過分析群體間的遺傳多樣性和遺傳分化程度,從而調查青魚目前的種質資源狀況和遺傳關系,為青魚種質資源的保護和創新奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和DNA提取

本研究所用青魚分別收集于湖北石首、湖南湘江、揚州邗江、浙江嘉興、江西瑞昌和陜西新民四大家魚原種,以及江蘇吳江、廣東佛山和廣西西埌四大家魚良種場(表1)。將收集到的青魚樣本剪其鰭條,保存在無水乙醇中并儲存在-20℃冰箱。

表1 九個青魚群體采集信息Tab.1 Sampling Information of nine populations of M.piceus

使用pall corporation的96孔過濾板進行DNA的提取[8],使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度,分光光度計Nanodrop 2000(Thermo Scientific,美國)檢測A260/280值及濃度。

1.2 COⅠ基因序列引物設計及PCR擴增

引物設計根據NCBI中MT084757的COⅠ序列,使用Primier6設計引物,驗證其特異性后,交至上海生工生物公司合成。引物序列為5′-GGAATAGT GGGAACCGCTCT-3′和5′-GATGGCAAATACGGC ACCTA-3′。

PCR擴增PCR反應體系20 μL,包含2×TaqPCR MasterMix(含染料) 10 μL,ddH2O 6.5 μL,上下游引物各(濃度為10 μmol/L)1 μL,模板DNA 1.5 μL。PCR反應程序:94℃預變性3min;94℃變性30s,52℃退火30s,72℃延伸15s,35個循環;72℃延伸10min,4℃保存。PCR產物送至上海生工生物公司進行測序。

1.3 數據分析

使用Sequencher 5.4.6[9]軟件對測序結果進行多序列對比,使用DNASP5.0[10]軟件分析群體的突變位點(S)、單倍型數(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異數(K)、基因流(Nm),Network 5.0軟件進行單倍型網絡圖的繪制,Arlequin3.5[11]軟件計算遺傳分化指數、分子方差變異(AMOVA)分析,使用MEGA 5.0[12]軟件進行群體間遺傳距離的計算及進化樹的構建。

2 結果

2.1 序列分析

對 9個青魚群體的個體進行擴增和測序,將得到的序列結果進行校正、拼接、刪除兩端多余的序列后得到的COⅠ基因長度為1003 bp。4 種堿基在9 個群體的分布基本一致,A、C、G和T的平均含量分別為26.34%、27.26%、19.00%和27.39%,A+T含量(53.73%)高于G+C(46.27%)含量。COⅠ基因序列包含6個變異位點,全部為轉換位點,且以A/G之間的轉換為主。

2.2 遺傳多樣性分析

江蘇邗江群體的單倍型最多,有7種單倍型,湖北石首、湖南湘江群體有5種單倍型,廣西西埌群體、江西瑞昌群體和江蘇吳江群體有4種單倍型,陜西西安群體和廣東佛山群體有3種單倍型。9個群體的單倍型多樣性為0.403—0.847,江蘇邗江群體的單倍型多樣性最高,為0.847(Hd＞0.800),除廣東佛山外其他青魚群體單倍型多樣性也較高(0.500＜Hd＜0.800),而廣東佛山群體遺傳多樣性最低,為0.403。9 個群體的核苷酸多樣性為0.00109—0.00244,青魚群體整體核苷酸多樣性較低,江蘇邗江群體的核苷酸多樣性最高 (π=0.00244),而廣東佛山的核苷酸多樣性最低(π=0.00109)。江蘇邗江群體中的平均核苷酸差異數最多為 1.86207,廣東佛山群體最少為0.83131(表2)。

表2 青魚群體COⅠ基因遺傳多樣性參數Tab.2 Genetic diversity parameters of COⅠ gene in M.piceus population

2.3 青魚群體遺傳分化及系統發育

基于Kimura2-paramester模型計算了9個青魚群體的種內和種間遺傳距離(表3)。佛山群體與西安群體、吳江群體,西安群體與吳江群體間的遺傳距離最小為0.001,其余群體間遺傳距離相同,且大多集中在0.002。西埌與湘江、邗江群體,瑞昌與湘江群體間的遺傳距離最大為0.003,在本實驗中,青魚各群體間的遺傳距離在0.001—0.003,遠未達到亞種的分化標準[7]。

表3 基于COⅠ基因序列的青魚群體間的遺傳距離Tab.3 Genetic distance between populations of M.piceus based on COⅠ gene sequence

計算了COⅠ基因的群體間Fst指數,并且計算了群體間的基因流Nm(表4)。結果顯示:9個群體間的Fst遺傳分化系數1為-0.0033—0.23445,基因流Nm為0.51604—1.13224,9個青魚群體間存在一定的遺傳分化,也存在一定的基因交流[13]。

表4 青魚9個群體間COⅠ遺傳分化和基因流Tab.4 Pair wise Fst of COⅠ between 9 M.piceus populations

NJ進化樹顯示(圖1),江蘇邗江群體與湖南湘江群體聚成一個分支,再與浙江嘉興群體聚成一支,廣東佛山、陜西西安、江蘇吳江聚為一支,廣西西埌與江西瑞昌聚為一支,再與湖北石首聚為一支,兩支姐妹分支聚集在一起,最終與浙江嘉興,湖南湘江,江蘇邗江群體聚在一起。

圖1 基于COⅠ基因序列構建的青魚9個群體NJ進化樹Fig.1 NJ evolutionary trees of nine M.piceus populations of M.piceus based on COⅠ gene

在9個青魚群體間COⅠ序列的分子變異(AMOVA)結果中(表5),青魚群體間遺傳變異占比為9.67%,群體內遺傳變異占比為90.33%,9個青魚群體的遺傳變異主要來源于群體內。

表5 青魚群體間 COⅠ 基因的 AMOVA 分析Tab.5 AMOVA analysis of COⅠ gene in populations of M.piceus

2.4 單倍型分析

271尾青魚COⅠ序列共檢測到7個單倍型,編號為Hap1—Hap7,其中Hap4在9個群體中都有分布,其次是Hap1和Hap3在8個群體中有分布,Hap2在7個群體中有分布,Hap5在3個群體中有分布,Hap6、Hap7在兩個群體中有分布,沒有發現獨享單倍型(表6)。圖 2展示的是使用基于Median-joining法構建的單倍型網絡圖,網絡的中間位置一般是古老的單倍型,其余單倍型可以通過單一突變和多步突變相連接,在古老單倍型周圍呈現出星狀分布[10],單倍型Hap4在9個群體中都有分布,并且處于單倍型網絡的中央,因此可能是較為原始的單倍型,由單倍型網絡圖以及單倍型在各個群體中的分布可知,單倍型的地理分布與青魚群體的地理位置分布沒有明顯的相關性。

表6 七種單倍型在青魚9個群體中的分布Tab.6 7 Haplotypes distribution of COⅠ gene in 9 M.piceus populations

圖2 九個群體青魚COⅠ基因單倍型網絡圖Fig.2 The haplotype network of M.piceus based on COⅠ gene in 9 populations

3 討論

對青魚群體的遺傳多樣性進行研究是保護青魚種質資源的前提條件,具有較高的遺傳多樣性的種群的生存概率越高。目前,COⅠ基因已經被廣泛地應用到了水產動物的群體遺傳研究中[14—16]。

3.1 青魚的遺傳多樣性

對9個青魚地理群體共271個個體線粒體COⅠ基因區段的遺傳多樣和單倍型進行了研究。青魚群體的總體單倍型多樣性較高,但是核苷酸多樣性較低,與謝啟明等[4]利用線粒體Cytb基因分析得出的結果相近。就遺傳多樣性而言,湘江群體高于瑞昌群體,與方耀林等[17]得到的結果一致。付曉燕等[3]通過對青魚線粒體Cytb基因的分析,發現珠江水系廣東云浮的遺傳多樣性比長江水系的青魚遺傳多樣性要低。本研究中來自良種場的養殖群體廣東佛山青魚單倍型多樣性和核苷酸多樣性都比其他青魚群體低,也說明了廣東地區青魚的遺傳多樣性可能偏低。來自良種場的養殖群體江蘇吳江群體遺傳多樣性低于其他野生群體,與Zhou等[18]發現的結果相一致,此外,這也與王沈同等[19]分析結果一致。

與單倍型多樣性相比,核苷酸多樣性的累計時間要更長,在一定程度上更能反映群體的遺傳多樣性,本研究中除了廣東佛山群體表現出低Hd低π型,其余群體均表現出高Hd低π型(Hd＞0.05,π＜0.005)型,根據Grand等[20]的理論,我們推測表現出廣東佛山群體可能經歷過瓶頸效應,而高Hd低π型的8個群體經歷過快速的種群擴張事件。由于某些原因,在短時間內,8個種群的數量急劇增加,從而導致單倍型多樣性的急劇增加,但是核苷酸的變異速度要慢得多,沒有足夠充足的時間來積累核苷酸變異,因此表現出高Hd低π型。

3.2 青魚的群體遺傳分化

群體間的遺傳分化程度可以用遺傳分化指數來表示[21],通常認為Fst＜0.05為低度遺傳分化;當0.05＜Fst＜0.15時為中度的遺傳分化;當0.15＜Fst＜0.25時為高度的遺傳分化,當Fst＞0.25時遺傳分化極大。在本研究中,9個群體間的Fst值在-0.0033—0.23445,群體間的遺傳分化在低度至高度之間,主要存在于低度和中度分化水平。推測由于青魚的洄游性,每年洄游至產卵場產卵的繁殖行為,使得各個群體之間產生了一定的基因交流,從而削弱了環境對群體分化的影響,使得野生群體之間分化不明顯。

在通常情況下,基因交流的概率會隨著地理距離的加大而減小,也更容易出現遺傳分化。但是也有研究發現由于環境的作用,遺傳距離與地理距離也會存在沒有明顯相關性。朱曉東等[22]發現鰱群體間的遺傳距離與地理距離的遠近沒有明顯的相關性,劉紅艷等[23]研究發現黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)群體間遺傳距離與地理距離也無明顯相關性。王豐等[6]使用微衛星分析了青魚的遺傳結構,其結果顯示,江蘇吳江群體與江蘇邗江、浙江嘉興群體的遺傳距離較近,但是其遺傳距離反而較遠,推測可能是由于太湖擁有大面積的湖泊環境,而其他4個群體不存在類似的水文條件。本研究發現廣西西埌群體和江西瑞昌、浙江嘉興群體地理距離較遠,但遺傳距離較近,廣東佛山群體和江蘇吳江群體也是如此。相反廣西西埌群體和廣東佛山群體的地理距離較近,遺傳距離卻較遠。系統發育樹同時也證實了這種情況,而在單倍型的統計中也發現,單倍型的分布與青魚群體的地理位置分布沒有明顯的相關性,可能與其特殊的水域環境或來源有關。

本研究通過分析9個青魚群體的遺傳變異,發現9個群體的遺傳多樣性總體較低,遺傳分化程度在低度至高度之間,主要表現在低度和中度分化,群體之間有著一定的基因交流,為青魚種質資源的保護和開發提供了重要的理論依據。