脂質體莪術醇逆轉卵巢癌順鉑耐藥作用的機制

楊潔真，王 晶，宋永紅，唐 勤，吳 強,3

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其病死率位居女性惡性腫瘤第五位[1]。導致卵巢癌病死率較高的主要原因之一是腫瘤復發后對化療藥物的耐藥，耐藥不僅限制了卵巢癌復發患者的二次手術機會，對晚期卵巢癌的初次減瘤手術也有較大的影響，因此尋找降低卵巢癌化療耐藥性的治療方案是目前研究熱點之一[2-3]。中藥有效成分聯合傳統化療藥物，能增強腫瘤細胞對藥物的敏感性，降低腫瘤細胞對一線化療藥物的耐藥程度[4]。莪術醇是衡量中藥莪術油藥效的重要指標之一，課題組前期利用脂質體運載莪術醇，發現脂質體莪術醇(liposome curcumol, LC)能有效發揮抗卵巢癌作用[5]，并且與順鉑聯合使用后能提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性，促進其凋亡[6]。但是LC是否能夠降低卵巢癌細胞對順鉑的耐藥程度，目前未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌細胞株SKOV3(上海賽百慷生物技術股份有限公司)；卵巢癌順鉑耐藥細胞株SKOV3/DDP由安徽醫科大學基礎醫學院實驗室提供; 脂質體莪術醇(由合肥工業大學合成)；順鉑(D109812)、氯化銦(I196212)、二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DDTC, S302932)(上海阿拉丁試劑有限公司)；乙腈(A955-4，美國ThermoFisher公司)；凋亡試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；利福平(沈陽紅旗制藥有限公司)；CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；β-actin(66009-1g)、Anti-P Glycoprotein(P-gp，22336-1-AP)(美國proteintech公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠、抗兔(北京中杉金橋生物技術有限公司)；逆轉錄和qPCR 試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；qRT-PCR引物(安徽通用生物股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人卵巢癌細胞株SKOV3用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養，SKOV3/DDP在常規培養基中加入200 ng/ml順鉑，37 ℃、5% CO2條件下培養，使用前在無順鉑常規培養基中培養一周。

1.2.1.1細胞分組 SKOV3/DDP細胞分成：① 空白對照組：常規培養基；② 陰性對照組：含12.5 μg/ml脂質體培養基；③ 順鉑組：含4 μg/ml順鉑的培養基培養24 h；④ LC組：含20 μg/ml的LC培養基培養48 h；⑤ 聯合組：含順鉑(4 μg/ml)+LC(20 μg/ml)的培養基， 細胞先用含20 μg/ml的LC培養基培養24 h，再與含順鉑(4 μg/ml)+LC(20 μg/ml)的培養基培養24 h。

1.2.1.2激動劑分組 ① 利福平組：用培養基稀釋利福平粉末，配成10 μmol/L的溶液，培養細胞24 h；② 利福平+順鉑組: 用含利福平(10 μmol/L)+順鉑(4 μg/ml)的培養基培養24 h；③ 利福平+LC組: 細胞先與含利福平(10 μmol/L)+LC(20 μg/ml)的培養基培養24 h, 再與20 μg/ml的LC培養基培養24 h；④ 利福平+LC+順鉑組: 細胞先與含20 μg/ml的LC+利福平(10 μmol/L)培養基培養24 h, 再與含LC(20 μg/ml)+順鉑(4 μg/ml))的培養基培養24 h。

1.2.2CCK-8法測細胞活力 在各組細胞中，加入CCK-8溶液10 μl/孔，37 ℃培養2 h，用酶標儀檢測450 nm波長吸光度，實驗重復三次。細胞活力=(實驗組-無細胞培養基組)/(對照組-無細胞培養基組)×100%。使用Graphpad回歸模型計算半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.2.3液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS)測定細胞內順鉑含量 各組取細胞沉淀，用超聲裂解后制備順鉑衍生物，細胞懸液加內標氯化銦，加5% DDTC溶液，45 ℃孵育20 min，加300 μl乙腈混勻，離心取上層溶液過濾，用HPLC-MS測定細胞內順鉑平均含量(順鉑平均含量用順鉑衍生物與內標銦峰面積的比值/細胞數表示)。色譜柱：Thermo Syncronis C18柱(1 μm×2.1 mm×100 mm)；流動相A相為乙腈，B相為0.1%甲酸水。質譜條件：離子源：HESI源；噴霧電壓：4 000 V(+)；離子化模式：ESI+；毛細管溫度：320 ℃；掃面模式：選擇離子監測SIM模式，鉑的衍生物：C15H29N3S6Pt ([M+H]+=639.04062)，內標銦的衍生物：C10H19N2S4In ([M+H]+=410.95426)。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 不含EDTA的胰酶消化、收集各組細胞后，加入400 μl的AnnexinV結合液重懸細胞，再加入5 μl AnnexinV染色液室溫避光孵育15 min，然后加入5 μl的碘化丙啶孵育5 min，最后使用流式細胞分析儀檢測樣本，用CytExpert軟件進行分析。

1.2.5qRT-PCR檢測P-gp mRNA相對表達量 收集各組細胞，利用Trizol提RNA，使用諾唯贊逆轉錄試劑將總RNA逆轉錄成cDNA，按照qPCR試劑盒說明進行引物擴增，最終數據以2-ΔΔCt值進行計算。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6Western blot檢測P-gp蛋白表達情況 提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，10% SDS-PAGE凝膠，200 mA、140 min轉移到PVDF膜，封閉，加一抗P-gp(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，加入二抗室溫孵育1.5 h，ECL進行發光反應，β-actin作為內參，使用ImageJ軟件進行灰度分析。

1.2.7免疫細胞化學檢測P-gp蛋白表達情況 常規準備細胞爬片，甲醛固定，用0.2% TxitonX-100處理5 min，3% H2O2處理5 min，加入一抗P-gp(1:400)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明后加封片劑封片。

1.3 統計學處理使用 Prism 8.0 進行統計分析，數據以表示。通過未配對的t檢驗分析兩組之間的差異，多組均數間的比較采用單因素方差分析及其兩兩比較方法LSD法，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑聯合LC對SKOV3/DDP細胞增殖的影響如圖1A所示，與不同濃度順鉑培養后，SKOV3/DDP的細胞活力(FSKOV3/DDP=220.6,IC50=28.36±2.71 μg/ml,P<0.05)高于SKOV3細胞(FSKOV3=573.0,IC50=7.64±0.58 μg/ml,P<0.05)。圖1B所示，與不同濃度LC培養后，SKOV3/DDP細胞活力呈濃度梯度依賴性降低(F=989.1,P<0.05)，IC50為(126.8±5.07)μg/ml，當LC藥物濃度為20 μg/ml時，細胞活力值為90%以上，因此在后續研究中以LC藥物濃度20 μg/ml為標準。圖1C所示，與順鉑組相比，聯合組細胞活力呈順鉑濃度梯度依賴性地降低(F順鉑組=340.8vsF聯合組=363.7，P<0.05)，當順鉑濃度為4 μg/ml時，聯合用藥能抑制SKOV3/DDP細胞的增殖(P<0.05)。圖1D提示，不同濃度的裸脂質體對SKOV3/DDP細胞活力無明顯的抑制作用。

圖1 順鉑與LC聯合用藥對SKOV3/DDP細胞活力的影響

2.2 LC對SKOV3/DDP細胞內順鉑平均含量的影響如表2所示，順鉑組和聯合組細胞內順鉑平均含量呈時間梯度依賴性增高，聯合組細胞內順鉑平均含量高于單用順鉑組，差異有統計學意義。

表2 順鉑組與聯合組在不同時間點SKOV3/DDP細胞內的順鉑含量

2.3 順鉑與LC聯合用藥對細胞凋亡的影響與對照組(4.62%±1.32%)相比，順鉑組(23.11%±2.96%)和聯合組(54.34%±3.37%)凋亡率均增加，聯合組細胞凋亡率在四組中最高(F=242.0，P<0.05)，見圖2。

圖2 順鉑與LC聯合用藥對細胞凋亡的影響

2.4 LC通過抑制P-gp蛋白表達逆轉SKOV3/DDP細胞對順鉑的耐藥性如圖3A所示，與SKOV3相比，SKOV3/DDP細胞中P-gp蛋白表達水平上升(t=14.08,P<0.05)。如圖3B所示，LC作用48 h能抑制SKOV3/DDP細胞中P-gp蛋白的表達量(F=80.46,P<0.05)。如圖3C和D所示，與順鉑組相比，聯合用藥組P-gp mRNA和蛋白的相對表達水平下降(FmRNA=115.5,F蛋白=258.4,P<0.05)。免疫細胞化學結果顯示，聯合用藥能抑制P-gp蛋白在SKOV3/DDP細胞的胞質和胞膜中的表達(圖3E)。

圖3 LC通過抑制P-gp蛋白表達逆轉SKOV3/DDP細胞的順鉑耐藥

2.5 P-gp活性激動劑可逆轉LC介導的P-gp蛋白表達Western blot結果提示，P-gp活性激動劑利福平能促進SKOV3/DDP細胞中P-gp蛋白的表達，并部分恢復聯合用藥后SKOV3/DDP細胞P-gp蛋白的表達 (F=41.43,P<0.05)。

3 討論

卵巢癌的發病率大約在5%，但其病死率位居女性生殖系統惡性腫瘤首位[1]。在卵巢癌臨床治療中，化療藥物的使用顯著延長了腫瘤患者的生存年限[7]。然而，化療耐藥的出現嚴重制約了化療的效果，甚至導致治療的失敗。因此，如何逆轉卵巢癌細胞順鉑耐藥成為改善卵巢癌患者預后的關鍵環節。在本研究中，以前期研究為基礎，發現脂質體莪術醇聯合順鉑可明顯降低卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP細胞活力，促進凋亡，降低細胞中P-gp蛋白的表達，增強SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性。

多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)作為耐藥機制中最常見的原因之一，主要涉及腺苷三磷酸(ATP)結合盒轉運體(ATP-binding cassette, ABC)超家族，其能將多種物質跨膜轉運，保護機體免受有毒代謝物和化合物的傷害。ABC外排轉運體在腫瘤細胞中過表達能夠限制化療藥物的長期有效使用，形成MDR[8]。P-gp是ABC轉運蛋白B亞族，為MDR1的表達產物。化療后，腫瘤細胞內P-gp表達升高，其通過與化療藥物結合，由ATP供能將細胞內藥物泵出細胞外，促使細胞內藥物濃度降低，從而產生耐藥[8]。本研究發現，卵巢癌細胞中，相比于SKOV3，SKOV3/DDP中的 P-gp 蛋白表達水平明顯上調。聯合用藥組P-gp的mRNA和蛋白表達水平下調。這與Gao et al[9]研究一致，P-gp在卵巢癌細胞中的表達水平與腫瘤的多藥耐藥呈正相關，P-gp促進細胞將各種化療藥物外排導致卵巢癌患者的多藥耐藥。

大量研究發現，莪術醇作為中藥莪術揮發油中提取的有效單體成分，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤作用[10]，當與化療藥物聯用時，可增強化療療效并對腫瘤細胞有殺傷作用[11]。Huang et al[12]研究表明，莪術醇可通過抑制PI3K/AKT通路激活，提高人胃癌細胞對順鉑的敏感性。莪術醇通過靶向miR-181b-2-3p-ABCC3軸抑制三陰性乳腺癌增長，增強其對阿霉素的敏感性[13]。課題組前期研究[6]發現，LC可通過抑制PI3K/AKT信號通路激活，進一步增強順鉑抗卵巢癌作用，并降低順鉑的IC50。在本研究中，通過HPLC-MS檢測細胞內順鉑平均含量[14]，發現順鉑聯合LC用藥促進細胞內順鉑平均含量的增高。實驗發現，LC作用48 h對SKOV3/DDP細胞的P-gp表達抑制效果最佳，但是臨床順鉑常用一日方案，因此我們在設計聯合用藥方案時，將 LC與細胞先培養24 h后，再與順鉑聯合作用24 h，這為藥物將來的臨床轉化提供理論依據。

圖4 P-gp活性激動劑(利福平)影響LC抑制SKOV3/DDP細胞P-gp蛋白的表達量

綜上所述，本研究發現順鉑與LC聯合用藥能增強SKOV3/DDP細胞對順鉑敏感性，該作用可能與抑制P-gp蛋白表達、增加細胞內順鉑的藥物平均含量有關。該研究為耐藥卵巢癌的治療提供新的思路，但是聯合用藥降低卵巢癌對順鉑耐藥的機制需要進一步深入研究。