HB-EGF和uPAR在子癇前期中發(fā)病的聯(lián)系

陳 繁，張 英，謝絲雨

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠所特有的疾病，若進(jìn)一步發(fā)展為子癇，可引起孕產(chǎn)婦抽搐，對(duì)心臟、肝臟、腎臟等各重要器官造成不可逆的功能損害。同時(shí)子癇前期孕婦宮內(nèi)環(huán)境較差，引起胎兒慢性缺氧，導(dǎo)致胎盤(pán)早剝，造成胎死宮內(nèi)等不良妊娠結(jié)局[1]。一項(xiàng)薈萃實(shí)驗(yàn)表明，患有子癇前期的孕婦，以后患高血壓的概率是正常人4倍，患心臟病的概率比正常人高兩倍[2]。目前有證據(jù)支持胎盤(pán)在疾病的發(fā)生中起著重要的作用，終止妊娠娩出胎盤(pán)才能阻止疾病的發(fā)展。滋養(yǎng)細(xì)胞異常浸潤(rùn)導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈的重鑄缺陷、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是目前的共識(shí)[3]。本研究主要探究肝素結(jié)合型表皮生長(zhǎng)因子(hepafin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF)和尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)是否與子癇前期的發(fā)病相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 病例資料首先選擇2018—2020年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩孕婦80例，其中30例正常足月妊娠，50例子癇前期病例，隨機(jī)選取其中4例子癇前期患者以及3例正常足月妊娠患者的血清進(jìn)行蛋白芯片技術(shù)篩選差異性蛋白。其子癇前期組納入標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)(ASOG)于2020年發(fā)布的對(duì)于子癇前期的診斷[4]，納入標(biāo)準(zhǔn)：① 妊娠20 周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg，伴尿蛋白陽(yáng)性；② 無(wú)蛋白尿但合并以下任何一項(xiàng)者：血小板減少；肝功能異常；腎功能損害；肺水腫；新發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常或視覺(jué)障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 既往患高血壓；② 糖尿病；③ 甲狀腺功能異常；④ 妊娠期肝內(nèi)膽汁瘀積癥；⑤ 肝臟以及腎臟疾病等合并癥的孕婦。研究對(duì)象均無(wú)吸煙史以及長(zhǎng)期服藥史。所有參與患者均為剖宮產(chǎn)方式終止妊娠并均簽署知情同意書(shū)，本研究獲得安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：P2020-12-22)。

1.2 標(biāo)本保存和試劑于孕婦手術(shù)當(dāng)天空腹采取靜脈血2～3 ml，室溫25 ℃靜置30 min，2 h后離心(3 000 r/min，10 min)，收取上清液，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存。術(shù)中收集胎盤(pán)組織浸泡于5倍體積的RNAlater液中，4 ℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。樣本使用時(shí)在常溫融化后研磨提取RNA。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D system公司；抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司；GSH-CAA-400試劑盒購(gòu)自美國(guó)RayBiotech公司；組織RNAFixer儲(chǔ)存液購(gòu)自北京普魯頓生物科技有限公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen生物有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)，并購(gòu)自該公司。

1.3 抗體芯片技術(shù)從患者獲得的血清用于鑒定基因通過(guò)人類細(xì)胞因子抗體陣列顯示子癇前期患者中的差異表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟按照GSH-CAA-400試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。具體步驟如下：將樣品稀釋液與玻片芯片室溫反應(yīng)1 h后，抽去稀釋液后，加入樣品4 ℃孵育過(guò)夜，在用專用洗滌液充分洗滌，洗去非特異性結(jié)合物，加入檢測(cè)抗體，室溫?fù)u床孵育2 h，再次充分洗滌后，加入Cy3-鏈霉親和素后，室溫避光搖床孵育1 h后，運(yùn)用InnoScan 300微陣列掃描儀，使用RayBiotech分析工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。再將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，運(yùn)用Normalization 數(shù)據(jù)來(lái)做分析并進(jìn)行組間比較。

1.4 ELISA采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中HB-EGF、uPAR中的濃度。ELISA實(shí)驗(yàn)前，將所收集的樣本置入冰上解凍，渦旋混勻。HB-EGF血清樣本未進(jìn)行稀釋，uPAR血清樣品運(yùn)用樣品稀釋液稀釋5倍，渦旋進(jìn)行混勻。每個(gè)孔加入100 μl的RD1W分析稀釋液后，標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 μl標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)孔加入50 μl的稀釋后的血清樣本，室溫孵育2 h，充分洗滌，向每孔加入200 μl的uPAR結(jié)合物或者HB-EGF結(jié)合物，室溫孵育2 h，再次進(jìn)行充分洗滌，向每孔加入200 μl提前配好顯色劑避光孵育30 min，每孔加入50 μl終止液，在30 min內(nèi)放上酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)孔對(duì)應(yīng)的濃度值。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR將胎盤(pán)組織進(jìn)行剪碎，加入1 ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理，室溫靜置30 min，取澄清的勻漿液，加入200 μl三氯甲烷，劇烈震蕩后室溫放置30 min，4 ℃ 、10 000 r/min離心15 min,把水相轉(zhuǎn)移到新EP管中，加入異丙醇500 μl沉淀水相中的RNA，室溫放置60 min。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，去上清，用含DEPC的70%乙醇洗滌，4 ℃、7 500 r/min離心10 min，棄上清，用DEPC水溶解RNA沉淀，測(cè)定RNA濃度和純度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列(5′-3′)分別為uPAR 上游：5′-GGTGAAGAAGGGCGAAAGG-3′，下游：5′-CCAGAGTAGCGTTCGAGTG-3′； HB-EGF上游：5′-TTATCCTCCAAGCCACAAGCACTG-3′,下游：5′-GATGACCAGCAGACAGACAGATGAC-3′；內(nèi)參β-actin 上游：5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′,下游：5′-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件95 ℃、30 s，95℃、5 s，60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)。同時(shí)每個(gè)樣本設(shè)置復(fù)孔，采用2-△△ct計(jì)算uPAR和HB-EGF的表達(dá)水平，其中ct值為循環(huán)閾值。

1.6 免疫組化采用免疫組化SP法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。組織標(biāo)本切片置于65 ℃烤箱中烘烤60 min后，立即置于二甲苯中15 min，梯度乙醇脫水，水平搖床上用PBS液浸洗3遍，室溫下將切片置于0.3% Triton X-100中30 min，枸櫞酸鹽緩沖液中高壓修復(fù)，自然冷卻，切片浸于PBS液浸洗3遍；山羊血清37 ℃封閉1 h，輕輕甩去血清，一抗HB-EGF按1 ∶50稀釋，uPAR按1：700稀釋，陰性對(duì)照采用PBS代替一抗，4 ℃過(guò)夜，PBS浸洗3次，二抗37 ℃孵育30 min后DBA顯色，將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。將顯色后的片子用清水沖洗復(fù)染。結(jié)果判定由本院病理科醫(yī)生閱片后判定。以細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)每份標(biāo)本中的陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度所占百分比進(jìn)行評(píng)定，采用Image J進(jìn)行平均吸光密度值分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。先判斷計(jì)量資料是否符合正態(tài)分布，若計(jì)量資料符合正態(tài)分布，則以進(jìn)行描述，并且兩組數(shù)據(jù)運(yùn)用t檢驗(yàn)的方式，若計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)運(yùn)用中位(四分位間距)進(jìn)行描述，運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本臨床數(shù)據(jù)對(duì)納入研究的孕婦年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)、孕周、收縮壓、舒張壓、新生兒出生體質(zhì)量、Aparg評(píng)分、NICU住院時(shí)間等臨床信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表1。子癇前期組與正常孕婦相比，年齡和BMI (P>0.05)，終止妊娠孕周(P<0.05)，收縮壓、舒張壓、新生兒出生體質(zhì)量、1和5 minApgar評(píng)分比較(P<0.01)。

表1 樣本臨床信息

2.2 差異表達(dá)蛋白篩選使用RayBiotech分析工具對(duì)抗體芯片篩查原始數(shù)據(jù)用軟件歸一化后，選擇Normalization數(shù)據(jù)來(lái)做分析。采用P值和Foldchange對(duì)差異蛋白進(jìn)行篩選，P<0.05且Foldchange < 0.83 或者>1.2，在篩選出的12個(gè)差異蛋白中有10個(gè)蛋白在子癇前期中上調(diào)，IL-2Ra、IL-23、VEGFR1、Nidogen-1、Thrombomodulin、Transferrin、IP-10、Insulin、IL-10、uPAR；2個(gè)蛋白在子癇前期中下調(diào)，CEACAM-1及HB-EGF。見(jiàn)表2。

表2 抗體芯片技術(shù)篩選子癇前期與正常孕婦的差異蛋白

2.3 子癇前期組和對(duì)照組血清中HB-EGF與uPAR的濃度本次研究共篩選了12個(gè)蛋白指標(biāo)，通過(guò)大量閱讀文獻(xiàn)，選取其中2個(gè)差異蛋白，即 HB-EGF和uPAR。HB-EGF的ELISA結(jié)果的數(shù)據(jù)資料顯示其為偏態(tài)分布，子癇前期組為43.19(61.18) ng/L，對(duì)照組65.82(21.85) ng/L，子癇前期患者血清中的HB-EGF的濃度是低于正常孕婦組，P=0.043，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1A。uPAR的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)資料顯示其呈現(xiàn)正態(tài)分布，子癇前期組為(2 143.65±810.97) ng/L，對(duì)照組為(1315.11±191.35)ng/L，子癇前期患者血清中uPAR的濃度是高于正常孕婦組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.907，P=0.006)。見(jiàn)圖1 B。見(jiàn)圖1B。

圖1 HBF、uPAR在各組血清中的濃度分布

2.4 子癇前期組和對(duì)照組胎盤(pán)uPAR及HB-EGF的表達(dá)應(yīng)用 qRT-PCR技術(shù)測(cè)定胎盤(pán)中uPAR mRNA及HB-EGF mRNA的表達(dá)，其結(jié)果顯示，不論是正常胎盤(pán)還是子癇前期胎盤(pán)中uPAR的表達(dá)量極低，甚至不表達(dá)(結(jié)果未顯示)，子癇前期組胎盤(pán)中HB-EGF mRNA表達(dá)量(0.74±0.17)，正常對(duì)照組(0.29±0.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.764，P=0.006)。進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)的方法比較子癇前期患者和正常妊娠對(duì)照組胎盤(pán)中uPAR及HB-EGF的蛋白表達(dá)。uPAR在正常孕婦及子癇前期患者胎盤(pán)呈陽(yáng)性表達(dá)(圖2A、B)，在子癇前期患者胎盤(pán)中的表達(dá)低于正常孕婦，正常孕婦吸光度值中位數(shù)10.367(5.61)，子癇前期孕婦組平均吸光度值中位數(shù)6.01(7.61)，運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)，P=0.037，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HB-EGF在正常妊娠中呈陽(yáng)性表達(dá)，在子癇前期組表達(dá)量極低，甚至不表達(dá)(圖2C、D)，通過(guò)測(cè)量平均光密度，數(shù)據(jù)資料呈正態(tài)分布，在正常孕婦組平均光密度值(7.91±1.66)，子癇前期組平均光密度值(3.91±2.67)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.004，P=0.009)。

圖2 胎盤(pán)HB-EGF及uPAR在子癇前期及對(duì)照組中的免疫組化 ×400

3 討論

本研究通過(guò)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)子癇前期孕婦和正常孕婦血清中440種細(xì)胞因子進(jìn)行分析，篩選出了12個(gè)差異蛋白。這些差異蛋白在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化及遷移、凝血酶異常等方面具有關(guān)鍵作用，為子癇前期發(fā)病機(jī)制的深入研究提供了方向及依據(jù)。HB-EGF和uPAR與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)，在胚胎著床中起著關(guān)鍵作用，并且目前對(duì)于這兩種蛋白的研究較少。

HB-EGF可激活表皮生長(zhǎng)因子家族中ERBB/HER酪氨酸激酶受體，將生長(zhǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界的刺激反應(yīng)、細(xì)胞增殖、存活、黏附、遷移和分化等，對(duì)于胚胎發(fā)育是必需的[5]。它處于與子癇前期相關(guān)的病理生理異常的交匯點(diǎn)，即它的活性調(diào)節(jié)著滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)或滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞凋亡[6]。子癇前期患者的胎盤(pán)顯示滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加,而HB-EGF的外源性應(yīng)用可防止細(xì)胞凋亡及缺血再灌注損傷,HB-EGF的下降可以導(dǎo)致保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙的細(xì)胞系統(tǒng)失衡，尤其在妊娠早期，HB-EGF的缺乏可以阻礙細(xì)胞滋養(yǎng)層干細(xì)胞向絨毛外表型轉(zhuǎn)化構(gòu)成了先兆子癇的關(guān)鍵因素[7]。uPA系統(tǒng)在細(xì)胞侵襲、黏附和遷移中起著關(guān)鍵作用[8]。uPA可與uPAR結(jié)合，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的分泌。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的成分，從而促進(jìn)細(xì)胞入侵，MMPs的降低已證明與子癇前期有關(guān)[9]。

該研究通過(guò)比較子癇前期患者和正常妊娠對(duì)照組血清及胎盤(pán)中uPAR和HB-EGF的表達(dá)量,結(jié)果表明uPAR在子癇前期患者血清中表達(dá)升高，胎盤(pán)中表達(dá)失衡，mRNA表達(dá)水平極低甚至無(wú)表達(dá)，蛋白表達(dá)水平低于正常孕婦組。HB-EGF在子癇前期組血清中表達(dá)降低，胎盤(pán)中mRNA水平表達(dá)量降低，蛋白水平表達(dá)量降低，甚至無(wú)表達(dá)，由此推測(cè)它們?cè)谧影B前期的發(fā)病中起保護(hù)性作用，相關(guān)的發(fā)病機(jī)制涉及滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移侵襲以及血管內(nèi)皮功能失調(diào)。

目前的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在選擇臨床樣本時(shí)只考慮了子癇前期這一影響因素，忽略了孕周對(duì)于胎盤(pán)蛋白的表達(dá)可能存在的潛在影響，所以標(biāo)本的收集存在對(duì)照組及子癇前期組孕周不匹配的情況，接下來(lái)會(huì)進(jìn)一步選取孕周匹配的對(duì)照組進(jìn)行研究，同時(shí)也會(huì)將分組細(xì)化到孕周，了解不同孕周uPAR及HB-EGF的表達(dá)是否有差異，從而為子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究以及臨床預(yù)測(cè)治療提供更多有效的線索。