維生素D對慢性腎臟病小鼠認知功能的影響

李夢雨，張 森，張 麗，王德光

近年來，慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者發生認知功能障礙倍受重視，據統計，約48%的CKD患者在進入透析前已出現認知功能障礙[1]，且隨著腎衰竭進展，CKD患者的認知障礙發生率逐漸增加[2]。當出現認知功能障礙時，CKD患者生活質量降低、依從性下降，從而影響其臨床治療效果、增加死亡風險。研究[3-4]表明，CKD患者血中維生素D水平明顯低于健康人群，且隨著疾病進展，維生素D缺乏率逐漸增加，維生素D水平降低與CKD患者認知功能減退存在關聯。由于缺乏有關維生素D對CKD動物認知功能影響的報道，因此，該實驗擬研究維生素D對腺嘌呤誘導的CKD小鼠學習與記憶能力的影響，以期為臨床工作中改善CKD患者認知功能提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 56只SPF級雄性C57BL/6J小鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心，體質量(17±1) g，動物許可證號為：SCXK(皖)2017-001，倫理審批號：LLSC20210354。小鼠采用分籠飼養的方式，統一喂養于安徽醫科大學第二附屬醫院科研實驗中心，定期更換墊料，給予充足的飼料和飲用水，動物實驗室內溫度(22.0±2.0) ℃、濕度50%～60%，環境自然采光和通風，12 h光照+12 h黑暗。

1.1.2實驗試劑與儀器 骨化三醇(貨號：SC8910，北京索萊寶科技有限公司)；肌酐測定試劑盒(貨號：C011-2-1，南京建成生物工程研究所)；尿素氮測試盒(貨號：C013-2-1，南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(批號：20211104，南京建成生物工程研究所)；蘇木精染液(批號：716092，珠海貝索生物技術有限公司)；伊紅染液(批號：716101，珠海貝索生物技術有限公司)；Masson三色染色液(貨號：C191201，珠海貝索生物技術有限公司)。酶標儀(型號：RT-6000，深圳雷杜生命科學股份有限公司)；電熱恒溫箱(型號：DNP-9052BS-Ⅲ，上海三發科學儀器有限公司)；正置熒光顯微鏡(型號：Axiocam 503 Color，德國蔡司公司)；水迷宮視頻分析系統(型號：Morris，淮北正華生物儀器設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組、模型建立及維生素D干預 將小鼠隨機分為5組：對照(CON，n=8)組、模型(CKD，n=12)組、模型+低劑量干預(LVD，n=12)組、模型+中劑量干預(MVD，n=12)組、模型+高劑量干預(HVD，n=12)組。采用腺嘌呤飼料喂養法誘導CKD動物模型。小鼠分籠飼養，適應性喂養1周后，CON組繼續給予基礎飼料喂養，余4組小鼠給予0.2%腺嘌呤飼料喂養5周，5周后更換為普通飼料。造模第36天起，3組干預組小鼠分別以20、100[5]或500 ng/kg劑量腹腔注射骨化三醇，每周3次，CON組及CKD組小鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續給藥6周。

1.2.2Morris水迷宮實驗 在各組小鼠給藥結束后，采用Morris水迷宮對其認知功能進行評估。將水池分為4個象限，池壁上懸掛4個不同形狀的幾何圖案，作為小鼠辨別空間位置的視覺參照物，池內注入自來水，以無毒無味染料染白，水溫控制在(22.0±1.0) ℃，水池周圍懸掛藍色窗簾以分隔研究者和實驗動物，于第二象限中央放置平臺，位于水下1.0～1.5 cm。實驗包括：① 定位航行實驗：選定四個入水位置，將各組小鼠依次分別從此四處面朝池壁輕柔地放入水中，每天入水的四個位置順序隨機，記錄小鼠找到平臺所需要的時間(即為逃避潛伏期)，并允許其在平臺上停留10～15 s，若小鼠未能在60 s內爬上平臺，則將該小鼠潛伏期記錄為60 s，并用木棒將其引導至平臺上，且使之停留10～15 s。所有小鼠每日于固定時間段訓練，每只每次訓練時間間隔半小時以上，連續訓練4 d。② 空間探索實驗：定位航行實驗結束后，將平臺從水池中撤去，依次將各組小鼠從第四象限同一入水位置放入水中，記錄60 s內小鼠在原平臺象限的游泳時間及路程。

1.2.3血中肌酐、尿素氮水平及SOD活性測定 小鼠眼眶取血，分離血清，-20 ℃冰箱保存，測定小鼠血清中肌酐、尿素氮含量及SOD活性。

1.2.4腎組織病理 頸椎脫臼法處死小鼠，鈍性分離雙側腎臟，肉眼觀察腎臟長徑、色澤的改變，隨之浸于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，常規行石蠟包埋、切片、HE和Masson染色，在顯微鏡下進行腎組織病理學觀察。

2 結果

2.1 各組小鼠基本情況對照組小鼠反應靈敏、毛發光澤，模型組小鼠日漸精神不振、易脫毛、墊料潮濕嚴重。整個實驗過程中，無小鼠死亡。

2.2 各組小鼠血清肌酐、尿素氮含量各組小鼠血清肌酐、尿素氮水平差異有統計學意義(P<0.001)。與CON組相比，CKD組小鼠肌酐及尿素氮水平升高(P<0.001)。3組干預組小鼠血清肌酐值與CKD組相比均無統計學差異，LVD組小鼠尿素氮水平較CKD組下降(P<0.001)，而MVD及HVD組尿素氮水平與CKD組之間差異無統計學意義。

2.3 各組小鼠腎臟組織病理肉眼下，對照組小鼠腎臟形態飽滿，外觀紅潤、有光澤；模型組及干預組小鼠腎臟體積偏小，色澤蒼白，表面有粗糙的顆粒狀物質，見圖1。光鏡下，對照組腎小球及腎小管結構完整清晰，腎間質未見明顯膠原纖維；模型組及干預組腎小球部分萎縮，可見炎細胞浸潤、蛋白管型、間質纖維化，見圖2、3。

圖1 各組小鼠腎臟肉眼觀A：CON組；B：CKD組；C：LVD組；D：MVD組；E：HVD組

圖2 各組小鼠腎臟HE染色 ×200

圖3 各組小鼠腎臟Masson染色 ×200

2.4 各組小鼠水迷宮實驗結果如圖4、5所示，在定位航行實驗中，各組小鼠逃避潛伏期差異有統計學意義(P<0.01)，CKD組小鼠逃避潛伏期較CON組延長(P<0.01)，與CKD組相比，MVD、HVD組小鼠的逃避潛伏期縮短(P<0.05，P<0.05)，而LVD組小鼠逃避潛伏期與CKD組之間差異無統計學意義。見圖4。在空間探索實驗中，各組小鼠在原平臺象限游泳時間(P<0.01)及路程(P<0.01)差異有統計學意義，CKD組小鼠在原平臺象限游泳時間(P<0.01)及路程(P<0.01)較CON組減少，MVD、HVD組目標象限游泳時間(P<0.05，P<0.05)和路程(P<0.05，P<0.01)較CKD組增加，而LVD組與CKD組之間上述兩項指標差異無統計學意義，見圖5。

圖4 定位航行實驗中各組小鼠逃避潛伏期的比較

圖5 空間探索實驗中各組小鼠在原平臺象限游泳時間及路程的比較

2.5 各組小鼠血清SOD活性各組小鼠血清SOD活性差異有統計學意義(F=32.42，P<0.001)，與CON組相比，CKD組SOD活性降低(P<0.001)，與CKD組相比，LVD及MVD組SOD活性升高(P<0.001)，見圖6。

圖6 各組小鼠血清SOD活性的比較

3 討論

認知功能障礙是慢性腎臟病神經系統并發癥之一，是CKD患者死亡的獨立危險因素[6-7]，腎臟替代治療、營養干預等均和認知功能有關聯。維生素D作為一種多功能類固醇激素，除參與調節鈣磷代謝外，對大腦功能的調節亦產生影響。多項動物實驗證實，給予維生素D可顯著提高阿爾茲海默病[8]、糖尿病[9]等疾病動物模型的學習和記憶能力，但尚缺乏關于維生素D對CKD小鼠認知功能的影響的研究。故本實驗通過腺嘌呤飼料喂養法誘導CKD動物模型，觀察維生素D對CKD小鼠認知功能的影響。

目前，CKD動物模型的制備方法包括藥物、外科手術等，本研究采用0.2%腺嘌呤飼料喂養小鼠誘導CKD動物模型，從最終的生化數據看，模型組小鼠血清肌酐及尿素氮水平較對照組上升，且模型組腎臟與對照組相比在肉眼觀及組織學上均有所變化，和臨床實際情況較為吻合，與前人研究相比，本實驗所測得尿素氮值較高，且干預組和模型組之間肌酐、尿素氮差別不大，這可能與飼料配比蛋白質含量較高有關。Morris水迷宮是用于評價嚙齒類動物空間學習記憶功能的行為學實驗方法之一，它利用動物逃避水環境的特性，通過視頻分析系統對動物入水后尋找隱匿于水下的平臺所需要的時間、搜索策略進行觀察和記錄，借此推斷動物的認知功能。本研究結果顯示，與CON組相比，CKD組小鼠逃避潛伏期延長，且在原平臺象限游泳時間及路程減少，提示CKD小鼠學習記憶能力下降，這與Tang et al[10]的研究結果一致，說明在慢性腎臟病疾病狀態下存在認知功能障礙。而經維生素D干預后，CKD小鼠認知功能得到改善，主要表現為MVD及HVD組小鼠逃避潛伏期較CKD組縮短，且在原平臺象限停留時間及路程增加，提示維生素D可在一定程度上緩解CKD認知障礙。有研究指出[11]，過高劑量維生素D存在致死作用，但本研究過程中無實驗小鼠死亡，但未對維生素D有無肝臟、骨骼等器官功能障礙進行進一步研究，維生素D發揮不同生物學效應的安全劑量范圍仍需進一步探索。

既往研究表明，維生素D具有抗炎、抗氧化特性，它通過增加核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)表達、維持正常線粒體功能等途徑降低氧化應激[12]。氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態，隨之可造成機體組織不同程度的損傷，從而引起多種疾病的發生。慢性腎臟病疾病進展過程中存在嚴重的氧化應激[13]，在CKD早期階段，即可發生某些氧化應激相關標志物(如：氧化型谷胱甘肽、丙二醛、8-羥基鳥嘌呤脫氧核苷等)水平的改變[14]。SOD是一種能夠清除氧自由基的抗氧化酶，本研究觀察到CKD組小鼠血清SOD活性較CON組下降，而與CKD組相比，LVD及MVD組小鼠SOD活性增高，提示維生素D可能通過發揮抗氧化作用改善CKD認知功能。

綜上所述，CKD小鼠存在認知功能減退，維生素D或可通過抗氧化特性改善其認知，這為臨床上防治CKD認知功能障礙提供了理論依據，需要更多的研究以進一步探索慢性腎臟病認知功能障礙的發病機制和防治措施。