IL-1β誘導甲狀腺細胞UGRP1表達及其與Fas/FasL介導凋亡的相關性

陳翠萍，李阿楠，任翠平，沈際佳，左春林

自身免疫性甲狀腺病(autoimmune thyroid diseases, AITD)是一種器官特異性自身免疫性疾病，主要包括Graves病(Graves’ disease, GD)和橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis, HT)兩種臨床類型[1]。子宮球蛋白相關蛋白1(uteroglobin-related protein 1, UGRP1)由SCGB3A2基因編碼，主要在氣管、支氣管的上皮細胞中表達，在甲狀腺組織中也有少量表達[2]。人類UGRP1基因定位在染色體5q31-33，這是一個包含一組編碼大量Th2細胞因子且具有GD易感位點的基因區域[3-4]。前期研究[5-6]顯示88.4% HT及24.7% GD患者甲狀腺細胞中表達UGRP1，而正常甲狀腺細胞及甲狀腺腫瘤細胞中不表達或低表達UGRP1。GD和HT患者甲狀腺組織UGRP1與自殺相關因子(factor associated suicide, Fas)共表達，并且UGRP1陽性甲狀腺組織中IL-1β的表達量高于UGRP1陰性者。IL-1β主要是一種促炎細胞因子[7]，它在HT患者甲狀腺組織中大量表達，是唯一誘導甲狀腺細胞Fas表達的細胞因子，通過與廣泛存在的FasL結合誘導甲狀腺細胞凋亡[8-9]。在AITD患者尤其是HT患者的甲狀腺組織中UGRP1高表達，且UGRP1高表達的甲狀腺細胞中Fas表達也增高，但UGRP1高表達的具體機制、UGRP1高表達與Fas共表達之間是否存在關聯尚不清楚。Fas/FasL介導的凋亡是經典的AITD致病機制，本研究通過應用IL-1β誘導甲狀腺細胞，探討甲狀腺細胞UGRP1表達及其與Fas/FasL介導細胞凋亡的相關性。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑大鼠甲狀腺細胞FRTL-5(美國ATCC公司)；重組人IL-1β(吳江近岸蛋白質科技有限公司)；抗FasL抗體(美國R&D公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)；0.25 %胰酶細胞消化液(上海碧云天生物技術有限公司)；TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司);逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；SYBR Premix ExTaq Ⅱ定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；Annenxin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及干預 將FRTL-5細胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養基中，在37 ℃、5% CO2濃度的恒溫培養箱中培養。當細胞生長密度達70%左右時，用胰酶細胞消化液消化，按1/2或1/3進行傳代培養，或者按照合適濃度接種至細胞培養板中。用不同濃度(10、20、40 ng/ml)IL-1β刺激細胞，同時設置對照組(未加IL-1β)繼續培養48 h，收集細胞用于后期檢測。用IL-1β(40 ng/ml)刺激細胞，分別培養12、24、48 h，并設置對照組(0 h)，收集細胞用于后期檢測。用抗FasL抗體(5 μg/ml)預處理細胞45 min后，再加入IL-1β(40 ng/ml)刺激細胞，同時設立對照組(未加IL-1β及抗FasL 抗體)、IL-1β(40 ng/ml)組繼續培養48 h，收集細胞用于后期檢測。

1.2.2Real-time PCR法檢測mRNA 采用TRIzol法提取各組細胞總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，參考熒光定量PCR檢測試劑盒說明書使用Real-time PCR儀(Bio-Rad CFX96)檢測相關基因的表達水平。以GAPDH為內參，采用 2-ΔΔCt法比較分析目的基因mRNA表達水平。引物見表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 將細胞接種于6孔板中，設置對照組、IL-1β組和IL-1β+抗FasL抗體組。對照組(未加IL-1β及抗FasL抗體)和 IL-1β組(40 ng/ml)繼續培養48 h，IL-1β+抗FasL抗體組先予以抗FasL抗體(5 μg/ml)預孵45 min，再添加終濃度為40 ng/ml的IL-1β繼續培養48 h。使用不含EDTA的胰酶細胞消化液消化收集細胞。按照Annenxin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀(BECKMAN COULTER)檢測。記錄各組的細胞凋亡率，實驗重復3次。

2 結果

2.1 IL-1β對FRTL-5細胞Fas mRNA表達水平的影響與對照組相比，IL-1β組FRTL-5細胞Fas mRNA的表達水平呈劑量-時間依賴性增加。在不同濃度刺激下，20 ng/ml組(1.88±0.22)和40 ng/ml組(2.86±0.52)高于對照組(1.01±0.19)，差異有統計學意義(F=19.35，P=0.000 5)，如圖1A。在不同時間作用下，12 h組(1.92±0.51)、24 h組(2.38±0.09)和48 h組(3.63±0.28)高于對照組(1.00±0.08)，差異有統計學意義(F=40.31，P<0.000 1)，如圖1B。

圖1 IL-1β對FRTL-5細胞Fas mRNA表達水平的影響

2.2 IL-1β對FRTL-5細胞UGRP1 mRNA表達水平的影響與對照組相比，IL-1β組FRTL-5細胞UGRP1 mRNA的表達水平呈劑量-時間依賴性增加。在不同濃度刺激下，10 ng/ml組(1.74±0.27)、20 ng/ml組(2.34±0.45)和40 ng/ml組(2.94±0.22)高于對照組(1.01±0.18)，差異有統計學意義(F=23.11，P=0.000 3)，如圖2A。在不同時間作用下，24 h組(1.85±0.17)和48 h組(2.12±0.12)高于對照組(1.01±0.18)，差異有統計學意義(F=24.96，P=0.000 2)，如圖2B。

圖2 IL-1β對FRTL-5細胞UGRP1 mRNA表達水平的影響

2.3 IL-1β及抗FasL抗體對FRTL-5細胞凋亡率的影響流式細胞術檢測細胞凋亡率結果顯示IL-1β(40 ng/ml)組細胞的早期凋亡率較對照組升高(7.49±1.91%vs28.46±3.17%；t=9.814，P=0.000 6)，IL-1β(40 ng/ml)+抗FasL抗體組細胞的早期凋亡率較IL-1β(40 ng/ml)組降低(28.46±3.17%vs19.20±1.75%；t=4.433，P=0.011 4)，如圖3。

圖3 IL-1β及抗FasL抗體對FRTL-5細胞凋亡率的影響

2.4 抗FasL抗體對FRTL-5細胞Fas mRNA及UGRP1 mRNA表達水平的影響與對照組相比，IL-1β(40 ng/ml)組，FRTL-5細胞Fas mRNA(1.01±0.09vs2.75±0.18；t=15.09，P=0.000 1)和UGRP1 mRNA(1.00±0.07vs2.22±0.31；t=6.687，P=0.002 6)表達水平增加；與對照組相比，IL-1β(40 ng/ml)+抗FasL抗體組Fas mRNA(1.01±0.09vs3.03±0.16；t=19.38，P<0.000 1)和UGRP1 mRNA(1.00±0.07vs2.66±0.28；t=9.856，P=0.000 6)表達水平增加；與IL-1β(40 ng/ml)組相比，IL-1β(40 ng/ml)+抗FasL抗體組Fas mRNA(2.75±0.18vs3.03±0.16；t=2.072，P=0.107)和UGRP1 mRNA(2.22±0.31vs2.66±0.28；t=1.811，P=0.144 4)的表達水平變化均無統計學差異。見圖4A、B。

圖4 抗FasL抗體對FRTL-5細胞Fas mRNA及UGRP1 mRNA表達水平的影響

3 討論

AITD是由遺傳因素、環境因素等相互作用而發生發展的一種自身免疫性疾病，輔助性T細胞在調節AITD患者甲狀腺免疫反應中的重要性已得到充分證實，GD主要以Th2細胞引起的體液免疫為主，HT主要以Th1細胞引起的細胞免疫為主[10]。UGRP1作為一種功能機制尚未明確的蛋白，已被證實是甲狀腺轉錄因子1的下游靶基因，該基因在AITD患者的甲狀腺中表達升高[11]。

AITD患者，尤其HT患者甲狀腺組織高表達UGRP1[5]，甲狀腺細胞UGRP1陽性HT患者血清TPOAb及TgAb陽性滴度高于UGRP1陰性患者[6]，而甲狀腺細胞UGRP1陽性的GD患者經過131I治療后更容易發生甲狀腺功能減退[12]，提示甲狀腺細胞UGRP1陽性GD患者傾向于HT的自然轉歸，推測UGRP1可能作為AITD特別是HT的一種新型生物學標志物，而且對于GD患者的甲減風險有一定預警意義。UGRP1與Fas在AITD患者的甲狀腺細胞中共表達，在UGRP1陽性的GD患者中，其甲狀腺組織中浸潤的單核細胞和巨噬細胞中IL-1β的表達量亦高于UGRP1陰性的患者[5]。本研究應用IL-1β刺激大鼠甲狀腺細胞，結果顯示在mRNA水平UGRP1和Fas表達呈升高趨勢，與AITD患者甲狀腺細胞UGRP1與Fas共表達且周圍浸潤的IL-1β高表達相吻合。長期以來Fas/FasL凋亡途徑是AITD尤其是HT的經典通路，既往研究[9]表明IL-1β是唯一一種通過Fas/FasL通路誘導甲狀腺細胞凋亡的細胞因子，為了探討UGRP1高表達與Fas/FasL介導細胞凋亡的相關性，本研究予抗FasL抗體預孵甲狀腺細胞，阻斷FasL與Fas相結合[13]，降低IL-1β誘導的細胞凋亡，結果顯示抗FasL抗體預孵的甲狀腺細胞早期凋亡率降低，但UGRP1表達水平并未出現顯著性變化。這一結果說明IL-1β誘導甲狀腺細胞UGRP1高表達與Fas/FasL介導的細胞凋亡不相關。

綜上所述，本研究結果表明IL-1β可以誘導甲狀腺細胞UGRP1與Fas高表達，并且可以促使甲狀腺細胞凋亡，但UGRP1高表達與Fas/FasL介導的細胞凋亡不相關。UGRP1與Fas/FasL介導的細胞凋亡之間的相關性仍有待進一步深入研究。