血清HSP90α和癌組織基因HSP90AA1在肺癌中的高表達及預后價值

董曉玉，鐘 濤，葉元滋，鄭美娟，沈繼龍

肺癌嚴重威脅人類健康，是癌癥相關死亡的主要原因，占全球因癌癥死亡人數的五分之一[1]。2020年美國新增肺癌患者約12.9萬人，其中肺癌病死率占全部因癌癥致死率的45%，位居病死率首位[2]。肺癌患者中大約80%～85%確診為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)和肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)是最常見的兩種組織學亞型。早期發現NSCLC對于術后良好預后至關重要，因為肺癌Ib期的5年生存率可達68%[3]，因此腫瘤標志物的監測對于肺癌的早期診斷和篩查具有優勢。熱休克蛋白(heat shock protein 90α，HSP90α)是近年來較熱門的腫瘤篩查指標，它是調節細胞凋亡的關鍵因子，可在一系列癌癥中高表達，有助于癌細胞的增殖、侵襲，例如乳腺癌、結直腸癌、肺癌、卵巢癌等，HSP90α可成為癌癥的一個潛在標識物[4]。該文主要探索HSP90α及癌組織基因HSP90AA1的表達在肺癌早期診斷，以及療效和預后中的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2019年8月—2021年8月在安徽醫科大學附屬巢湖醫院住院的109例肺癌患者為實驗組，其中男81例，女28例，年齡41～87(69.62±9.99)歲。本研究肺癌納入標準：所有患者均在初診時行纖維支氣管鏡或肺穿刺等經病理確診；未經化療、放療及手術的首診患者。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者。依據病理肺癌患者中鱗癌42例，腺癌41例，小細胞肺癌23例，神經內分泌癌2例，合并兩種類型的肺癌(左肺鱗癌，右肺小細胞癌)1例。肺部炎癥患者(包括肺部、支氣管感染)36例為參照組，所有患者均符合臨床診斷標準，其中男27例，女9例，年齡33～89(64.42±14.43)歲；對照組為安徽醫科大學附屬巢湖醫院體檢中心健康體檢者30例，其中男14例，女16例，年齡48～92(58.73±8.73)歲。各組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。入選對象或家屬均簽署知情同意書。本研究經安徽醫科大學附屬巢湖醫院倫理委員會批準(倫理編號：KYXM-202110-015)。

1.2 方法

1.2.1標本 所有入組人員均空腹靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，用于HSP90α和異常糖鏈蛋白(TAP)檢測；另取靜脈血4 ml，無添加劑，離心(4 000 r/min，8 min)后取血清進行腫瘤標志物檢測。

1.2.2實驗儀器和試劑 全自動化學發光儀MAGLUMI 2000 Plus及配套試劑盒檢測鱗狀細胞癌相關抗原(squamous cell carcinoma associated antigen，SCC)，其參考區間臨界值2.5 ng/ml為陽性判斷標準；羅氏E601電化學發光儀及配套試劑盒檢測胃泌素釋放肽前體(prn-gastrinreleasing peptide，ProGRP)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、細胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment，Cyfra21-1)、糖類抗原(carbohydrate antigen，CA72-4)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)，其參考區間臨界值分別為85.7 pg/ml、5.0 ng/ml、3.3 ng/ml、8.2 U/ml、24.0 ng/ml為陽性判斷標準；試劑為浙江瑞生醫療科技有限公司采用凝集法檢測TAP，其參考區間臨界值121.0 μm2為陽性判斷標準；試劑為煙臺普羅吉生物科技發展有限公司采用酶聯免疫法檢測HSP90α，其參考區間臨界值82.06 ng/ml為陽性判斷標準。

1.2.3HSP90AA1數據 通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數據庫下載數據，分析490例肺腺癌和485例肺鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織的HSP90AA1表達。通過Survminer包中surv-cutpoint函數計算得出HSP90AA1最優分界點，將腺癌、鱗癌分為高低兩組，比較兩組HSP90AA1與患者臨床參數的關系，同時行Cox比例風險回歸分析，探究肺癌患者生存的獨立危險因素。

2 結果

2.1 實驗組、參照組、對照組HSP90α的比較三組間血清HSP90α水平比較有意義(Z=77.69，P<0.01)實驗組高于參照組和對照組(P<0.01)，而參照組和對照組間無差異，見圖1。以炎癥組和體檢組為陰性組，肺癌組為陽性組作ROC曲線，判斷HSP90α在肺癌中的診斷效能，其曲線下面積為0.898(0.850，0.945)。以HSP90α>82.06 ng/ml為陽性判斷標準，其診斷肺癌的靈敏度為79.80%，特異度為97.10%，見圖2。

圖1 實驗組、參照組、對照組HSP90α的比較

圖2 HSP90α診斷肺癌的ROC曲線與對照組比較：**P<0.01；與炎癥組比較：##P<0.01

2.2 實驗組HSP90α水平與肺癌其他臨床參數的關系血清HSP90α在NSE陽性患者中表達高于NSE陰性者(χ2=6.594，P<0.05)；HSP90α與患者的其他臨床參數無明顯相關性，見表1。

表1 血清HSP90α水平與肺癌其他臨床指標的關系(n=109)

2.3 實驗組HSP90α水平與療效的關系肺癌患者在治療過程中，持續監測血清HSP90α水平，當影像學檢查提示腫瘤組織縮小或臨床病情緩解，HSP90α水平較初診結果降低(t=4.428，P<0.01)；影像學檢查提示腫瘤組織進一步增大或有遠處轉移提示病情進展，HSP90α水平較初診結果增高(t=3.173，P<0.01)。見圖3。

圖3 各時期血清HSP90α水平

2.4 血清HSP90α水平在肺腺癌、肺鱗癌、小細胞肺癌中的表達血清HSP90α水平在三組間表達有意義(Z=6.058，P<0.05)；腺癌組為92.88(62.13，122.61)ng/ml，其表達低于鱗癌組104.30(85.82，141.44)ng/ml和小細胞肺癌組123.73(89.64，135.08)ng/ml(P<0.05)，而鱗癌組和小細胞肺癌組間血清HSP90α水平無差異(P>0.05)，見圖4。

圖4 血清HSP90α水平在肺腺癌、肺鱗癌、小細胞肺癌中的表達與腺癌組比較：*P<0.05

2.5 HSP90AA1在肺腺癌和肺鱗癌組織中的表達HSP90α由基因HSP90AA1表達，通過TCGA分析490例肺腺癌和485例肺鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織的HSP90AA1表達。肺腺癌和鱗癌患者，癌組織中HSP90AA1表達均高于癌旁(F=11.61，P<0.01；F=51.28，P<0.01)；腺癌組織中HSP90AA1水平表達低于鱗癌組(F=58.36，P<0.01)，見圖5。由于小細胞肺癌發病率較低，TCGA沒有足夠的數據，故HSP90AA1在小細胞肺癌組未進行分析。

圖5 HSP90ΑA1在肺腺癌和肺鱗癌組織中的表達

2.6 肺癌患者臨床參數與HSP90AA1表達的分析通過Survminer包中surv-cutpoint函數計算得出HSP90AA1最優分界點，將腺癌、鱗癌分為高低組，比較HSP90AA1在癌組織中高表達組和低表達組與患者臨床參數的關系。兩組患者HSP90AA1表達水平與年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤殘余均無關。腺癌患者的生存狀態、疾病進展與HSP90AA1表達相關(P<0.05)，見表2；鱗癌患者的生存狀態與癌組織中HSP90AA1表達無關，而疾病進展與之相關(P<0.01)，見表3。提示癌組織HSP90AA1高表達者易復發。

表2 腺癌HSP90AA1與臨床參數的關系[n(%)]

表3 鱗癌HSP90AA1與臨床參數的關系[n(%)]

2.7 HSP90AA1在癌組織中的表達水平與患者預后評估通過K-M生存曲線，對患者的整體生存率(OS)、無病生存率(DFI)進行分析，腺癌患者HSP90AA1高表達者OS和DFI均低于低表達組(P<0.05)，而鱗癌患者癌組織HSP90AA1表達與其預后沒有統計學意義，但高表達者無病生存期有降低趨勢，見圖6。

圖6 HSP90AA1在癌組織中的表達水平對患者的預后分析A：肺腺癌患者的OS分析；B：肺腺癌患者的DFI分析；C：肺鱗癌患者的OS分析；D：肺鱗癌患者的DFI分析

2.8 HSP90AA1表達水平是肺癌患者的獨立預后因素單因素分析顯示肺腺癌的TNM分期、腫瘤殘余、HSP90AA1表達水平是患者的獨立預后因素(P<0.05)，而患者年齡、性別與預后不相關(P>0.05)；將上述因素納入多因素Cox回歸模型分析，TNM分期、腫瘤殘余、HSP90AA1的高表達是肺腺癌患者的獨立預后因素(P<0.05)，見表4。肺鱗癌患者的TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)、HSP90AA1表達水平是患者的獨立預后因素(P<0.05)，而患者年齡、性別、TNM分期(I期、Ⅱ期)、腫瘤殘余與預后不相關(P>0.05)；多因素Cox回歸模型分析顯示鱗癌患者的TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)、HSP90AA1表達水平是肺磷癌患者的獨立預后因素，見表5。

表4 影響肺腺癌患者OS的單因素和多因素Cox回歸分析(n=490)

表5 影響肺鱗癌患者OS的單因素和多因素Cox回歸分析(n=485)

3 討論

HSP存在于所有生物體中，是一種高度保守的ATP依賴性分子伴侶，它參與蛋白質的重塑和激活，負責蛋白質翻譯后的折疊和穩定性，促進細胞生長和增殖[5]。HSP90底物蛋白大多是過度表達或突變的基因，如p53基因、表皮生長因子受體、間質表皮轉化因子等蛋白[6]，因此HSP90促進惡性腫瘤且獲得耐藥性，亦被稱作“致癌成癮基因”[7]。HSP90有HSP90α和HSP90β兩個亞型，它們在細胞內、外水平極低；當機體微環境處于缺氧、損傷、氧化等狀態，細胞內HSP90α和HSP90β釋放到細胞外，僅HSP90α可變異分泌，由腫瘤細胞持續分泌至細胞外[8]。故檢測HSP90α及其特異性抗體水平在癌癥診斷中發揮重要作用。

該研究比較了肺癌組、肺部炎癥組、健康對照組的血清HSP90α水平，肺癌患者HSP90α水平顯著高于其他兩組(P<0.01)；ROC曲線亦表明HSP90α在肺癌中有較高的診斷價值。近年多項研究[9-10]揭示HSP90α在肺癌患者的血清、癌組織中均上調，且其上調與肺癌的發生、發展和轉歸密切相關；相反，抑制Hsp90可通過復雜的信號通路抑制癌細胞的增殖、運動和轉移。一份包含2 247名患者的隊列研究[11]顯示肺癌患者血漿HSP90α水平顯著升高，且與患者分期相關。HSP90α與肺癌其他輔助診斷標志物進行比較，109例肺癌患者86例HSP90α陽性，占比78.89%，除Cyfra21-1陽性率(80.73%)，其余指標陽性率比均低于HSP90α；有3例患者肺癌篩查指標均陰性，僅HSP90α陽性，可見HSP90α對肺癌的輔助診斷有臨床價值。HSP90α聯合傳統肺癌輔助標志物可提高其檢出率，從而早發現早治療[12]。另有研究報道[13]檢測患者的肺泡灌洗液，HSP90α的診斷效率優于Cyfra21-1和NSE。該研究發現腺癌組血清HSP90α水平相對于鱗癌、小細胞肺癌較低，這與其基因HSP90AA1在腫瘤組織中的表達相似。多項研究顯示HSP90α在NSCLC患者中比在對照個體中更豐富[6]。許 露 等[14]報道HSP90α聯合患者臨床資料對NSCLC的EGFR突變有預測價值。

由于該研究臨床資料有限，為獲得更多HSP90α在肺癌中表達的相關資料，通過TCGA分析了基因HSP90AA1在近千例肺癌組織中的表達。癌組織中HSP90AA1表達均高于癌旁(P<0.01)，且腺癌組織中HSP90AA1水平表達低于鱗癌組織(P<0.01)， Wang et al[15]報道HSP90AA1是促進肺鱗癌進展的相關基因。數據分析顯示HSP90AA1在肺腺癌和鱗癌組織中的表達與患者年齡、性別、腫瘤分期均無關；腺癌患者的生存狀態與癌組織中HSP90AA1表達相關，且HSP90AA1高表達患者OS和DFI均降低；肺鱗癌患者的生存分析顯示與HSP90AA1高表達雖無統計學意義，但整體有降低的趨勢。單因素和多因素Cox回歸分析亦發現HSP90AA1的表達水平是肺癌患者的獨立預后因素。從HSP90AA1的基因表達可以推斷出HSP90α與肺癌患者的生存和預后相關，但仍需大量的臨床數據支持。

該研究持續監測肺癌患者治療過程中血清HSP90α水平，當患者腫瘤組織縮小或病情緩解期HSP90α水平較初診結果降低；反之則增高。可見血清HSP90α水平可以監測腫瘤患者的療效。Zhong et al[6]研究結果顯示HSP90α可被認為是晚期NSCLC化療的有價值預測因子，其水平與化療后腫瘤緩解呈正相關。Shi et al[11]亦報道HSP90α可以預測肺癌患者對化療的反應。

綜上所述，HSP90α及HSPAA1在肺癌患者中高表達，當患者病情緩解，血清HSP90α水平降低，反之則增高；癌組織HSPAA1高表達患者預后不良。HSP90α可作為肺癌的一種輔助診斷指標，以及對肺癌的進展、療效和預后觀察具有一定的臨床價值。這些為肺癌治療的新方法—HSP90α抑制劑作為靶向藥物提供了理論依據，一系列HSP90α抑制劑的設計、合成，目前已取得突破性的進展，有望應用于臨床。