GRK5-Moesin通路在膠質母細胞瘤中的分布特點及作用

楊 洋，錢中潤，吳婧婧

膠質瘤是成人最常見的顱內原發惡性腫瘤，其中多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)惡性程度最高，預后極差。盡管當今醫療技術不斷發展精進，膠質瘤的治療還是以手術聯合放化療為主，GBM患者的中位生存期仍只有14個月左右[1-3]。GBM中存在大量低分化的膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)，被認為是引起腫瘤耐藥性和腫瘤復發的“元兇”[1-5]。G蛋白偶聯受體激酶5(G protein coupled receptor kinase-5, GRK5)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，其功能涉及多種病理過程。前期研究[6]表明GRK5的表達分布與膠質瘤干細胞有關。Moesin屬于ERM蛋白家族(The Ezrin-Radixin-Moesin proteins)[7]，可通過調節肌動蛋白改變細胞遷移活性。Moesin與腫瘤的發生發展有關[7-8]。前列腺癌研究[9]中提示Moesin是GRK5的磷酸化底物。GRK5通過磷酸化位點T66結合Moesin，靶向調控Moesin亞細胞分布[9]。而GRK5-Moesin在膠質瘤中的定位關系和分布特點尚不清楚。

該研究通過免疫組化和免疫熒光分析GRK5和Moesin在GBMs中的亞細胞定位和分布特點，以及GRK5-Moesin與腫瘤血管及膠質瘤干細胞的位置關系，進而研究上調/下調GRK5活性對Moesin的影響，以及對U87細胞生物學活性的改變。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器U87膠質瘤細胞系購自中國科學院細胞庫；細胞培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；GRK5上調質粒(GV358/GRK5)和GRK5敲減質粒(GV248/shRNA)慢病毒液購自上海GenePharma公司；RNeasy Mini Kit試劑盒購購自美國QIAGEN公司；AceQ SYBR Green Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物技術股份有限公司；GAPDH抗體購自美國Sigma公司、GRK5抗體購自中國南京Bioworlde公司；Moesin抗體購自美國Affbiotech公司；CD44抗體購自美國CST公司；細胞培養板購自美國Corning公司；熒光二抗均購自武漢塞維爾生物技術有限公司；超敏ECL發光試劑盒購自美國Thermo Fish公司；相關引物設計自美國Invitrogen公司。細胞增殖檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自日本東仁化學科技有限公司；Annexin V-PE/7AAD凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；細胞遷移侵襲實驗使用的BioCoatTMInvasion Chambers小室和Matrigel膠購自美國BD公司；實時定量PCR儀、生物安全柜和細胞培養箱等均購自美國Thermo Scientific公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；流式細胞儀來自美國Beckham公司；蛋白與核酸電泳設備購自北京六一生物科技有限公司。本研究中涉及的膠質瘤樣本均取自中國科學技術大學附屬第一醫院神經外科確診并手術的膠質瘤患者。所有患者術前均未接受化療或放療。所有患者術前均獲得知情同意。所有研究方法和程序均經中國科學技術大學附屬第一醫院倫理委員會批準(批號：2019-X(H)-029)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和病毒包裝細胞轉染 U87膠質母細胞瘤細胞系來自腦功能與腦疾病安徽省重點實驗室。該細胞系經中國科學技術大學附屬第一醫院倫理委員會批準使用[6,10-11]。細胞在DMEM培養基中添加10%胎牛血清，置于37 ℃、5% CO2的濕化培養箱中。用GRK5上調質粒(GV358/GRK5)和GRK5敲減質粒(GV248/shRNA)慢病毒液感染細胞。根據說明書加入1 μg/ml聚凝胺存和5 μg/ml嘌呤霉素(美國Sigma-Aldrich公司)到培養基中，將感染細胞傳代至10%匯合。未處理的U87細胞定義為空白對照組；表達GV358/GRK5、GV248/shRNA、LV-3陰性對照的細胞分別定義為U87-UP、U87-KD、NC組。采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)和Western blot檢測GRK5的表達。

1.2.2RNA分離和qRT-PCR 利用Qiagen RNeasy Mini Kit從膠質瘤細胞中提取總RNA。然后，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將2 mg RNA逆轉錄為cDNA。所有的程序都是按照制造商的說明進行的。采用AceQ SYBR Green Master Mix進行qPCR檢測。采用2-ΔΔCt法計算基因表達的倍數變化[6,11]。引物序列為：人GRK5，F：5′-AGGAGCT GAACGTGTTTGGA-3′, R：5′-TTGTTCTGATGCTGC CGCT-3′；人GAPDH，F：5′-TCGGAGTCAACGGAT TTGGT-3′, R：5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′。

1.2.3Western blot實驗 按照標準實驗步驟進行實驗[6,10]，GRK5(1 ∶500)和Moesin (1 ∶500)在4 ℃下過夜。使用抗GAPDH的抗體(1 ∶1 000)在室溫下1小時，使用ECL檢測系統通過化學發光觀察免疫反應蛋白。采用Image Pro Plus 6.0軟件測定蛋白條帶強度。

1.2.4細胞劃痕試驗 膠質瘤細胞在12孔板中培養。當細胞融合到80-90%時，用標準的200 μl槍頭尖在12孔板的單層細胞上制造出劃痕。在24和48 h，觀察細胞向刮拭區遷移，在固定觀察點使用顯微鏡拍攝圖像。通過測量細胞進入劃痕區域的運動來確定細胞遷移。使用Image J軟件進行定量分析，結果以百分比表示:傷口閉合面積相對于最初傷口面積的平均值[6,10]。

1.2.5侵襲試驗 采用BioCoatTMInvasion Chambers小室進行。用基質凝膠(Matrigel)包覆上室后將約 5 ×104個細胞用200 μl無血清DMEM重懸并加入上腔，在下室中加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM。37 ℃培養18 h后，去除膜上側細胞，用1%多聚甲醛固定膜下表面受侵細胞，用0.1%結晶紫染色。然后，在200倍光學顯微鏡下，每個小室選取8個隨機視野計數細胞，取平均數作為該小室的細胞計數[6,10]。

1.2.6細胞增殖實驗 采用CCK-8(日本DOJINDO)檢測細胞增殖。將2×104的膠質瘤細胞植入96孔培養皿中。培養24、48、72、96 h后，用含1 ∶10稀釋CCK-8的培養基替換培養基。在37 ℃下再孵育2 h后，用設置在450 nm處的分光光度計測量吸光度[6]。

1.2.7免疫熒光三重染色分析 針對膠質瘤組織切片，首先進行載玻片脫脂和抗原提取，將涂膠載玻片放入EDTA緩沖液(pH 8.0, 塞維爾生物技術有限公司，武漢)，加熱8 min。用含2.5%山羊血清和0.5% SDS的緩沖液在室溫下阻斷1 h。然后用兔抗人GRK5(1 ∶1 000)、小鼠抗人Moesin(1 ∶3 000)和小鼠抗人CD44(1 ∶2 000)抗體在0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline，PBS)、0.5%牛血清白蛋白和0.05% NaN2中過夜。沖洗玻片，用相應的二抗依次孵育：HRP標記山羊抗兔熒光二抗(1 ∶500)，HRP標記山羊抗小鼠熒光二抗(1 ∶500)，Cy5標記山羊抗小鼠熒光二抗(1 ∶400)，50 min/次。DAPI染核，蓋玻片覆蓋后熒光顯微鏡下觀察。針對U87膠質瘤細胞進行染色，首先將細胞重懸于含血清培養基，滴加到多聚賴氨酸包被蓋玻片上培養過夜。用40 g/ml多聚甲醛4 ℃固定30 min，0.2% TritonX-100通透10 min。山羊血清封閉30 min。再同時加上述抗體過夜，后續步驟同上。

1.2.8免疫組化及HE染色 石蠟包埋切片、脫蠟、水化，GRK5(1 ∶500)或Moesin(1 ∶500)或CD44(1 ∶500)作為一抗，嚴格按照試劑盒步驟操作。光鏡下觀察，染色結果判定：胞質或胞膜染成棕黃色為陽性。石蠟包埋的組織切片用10%多聚甲醛固定后行HE染色。

1.2.9細胞凋亡檢測 使用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒分析膠質瘤細胞凋亡，同時用Annexin V-PE和活性染料7-氨基-放線菌素D(7-amino-actinomycin D，7AAD)對腫瘤細胞進行染色。染色細胞立即用流式細胞儀進行分析。

2 結果

2.1 GRK5和Moesin在膠質瘤中共表達情況及與膠質瘤干細胞關系通過免疫熒光染色檢測U87膠質母細胞瘤細胞及高級別膠質瘤組織中GRK5與Moesin的表達相關性。結果顯示GRK5主要以在細胞胞質表達為主，在胞膜表達較少；Moesin在胞質表達較弱，而在細胞膜中表達較多。GRK5與Moesin的共表達部位在圖中顯示為黃色區域(圖1、2)。CD44作為另一種膠質瘤干細胞標志物，被發現在GBM細胞膜存在陽性表達(呈粉色，見圖1、2)；且在部分GBM細胞中可觀察到GRK5、Moesin與CD44三者共同定位于細胞膜上同一位置的共表達，見圖1、2。而作為對照，正常腦組織中GRK5、Moesin和CD44的免疫組化和免疫熒光染色均為陰性。

圖1 GRK5、Moesin及CD44在GBMs中存在共定位

2.2 GRK5、Moesin與膠質瘤“壁龕”樣結構關系光鏡及熒光顯微鏡下觀察，GBM組織樣本中存在許多類似“壁龕”樣的結構，CD44在此類結構中富集表達。熒光顯微鏡下觀察，壁龕結構中的腫瘤細胞內大多同時表達GRK5和Moesin，且壁龕中部分細胞存在GRK5-Moesin-CD44三者的共定位，見圖2。

圖2 GRK5-Moesin-CD44在膠質瘤細胞壁龕中富集

2.3 GRK5和Moesin在膠質瘤血管的分布研究顯示，GBM樣本中的血管附近細胞存在大量GRK5和Moesin陽性表達(圖3B、C)。另一方面，腫瘤中各個血管周圍GRK5陽性和Moesin陽性細胞的分布卻又存在明顯差異(圖3D～G)：圖3D中的血管結構以Moesin陽性表達為主，GRK5陽性表達較少。圖3E中的GRK5陽性細胞均勻分布于整個血管，Moesin陽性細胞則局限于血管內膜。圖3F中的血管結構以GRK5陽性細胞為主，Moesin陽性細胞較少。圖3G中的血管則表現為GRK5和Moesin共同分布，部分細胞中存在亞細胞共定位。

圖3 GRK5與Moesin在膠質瘤血管的表達和分布

2.4 建立GRK5上調/下調的U87穩轉細胞系利用GRK5上調/敲減質粒的慢病毒液對U87細胞進行轉染，建立穩轉細胞系(空白對照組：U87；陰性對照組：U87-NC；GRK5上調組：U87-UP；GRK5下調組：U87-KD)。鑒定結果顯示，與對照組相比，U87-UP組的GRK5的mRNA(F=75.823，P<0.01)和蛋白水平均提高(F=99.707，P<0.01)，而U87-KD組的GRK5的mRNA(F=27.780，P=0.002)和蛋白水平(F=9.900，P<0.05)均降低，差異有統計學意義，見圖4。

圖4 GRK5上調/下調可靶向調控Moesin表達

2.5 GRK5-Moesin表達改變對U87生物學活性的影響利用GRK5上調/下調穩轉細胞系，分析GRK5活性改變對膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。CCK-8實驗結果顯示，第48、72、96 h，GRK5-UP組細胞增殖能力較對照組及GRK5-KD組增強，而GRK5-KD組細胞增殖能力較對照組及GRK5-KD組減弱，見圖4D。如圖5A、B所示，細胞劃痕實驗，GRK5上調可提高U87細胞遷移能力，促進“劃痕”愈合(P<0.01，F=110.163)，而GRK5下調的U87細胞“劃痕”愈合明顯減慢(P<0.01，F=109.606)。Transwell實驗結果見圖5C、D，U87-UP組細胞的侵襲能力較對照組提高(P<0.01，F=84.961)，而U87-KD則降低(P<0.01，F=86.755)。流式細胞術檢測細胞凋亡發現，U87-UP組的膠質瘤細胞的凋亡較U87-NC及U87組相對減少(P<0.05，F=11.244)，而U87-KD組細胞凋亡比U87-NC及U87組增加(P<0.01，F=87.464)，見圖5E、F。

圖5 GRK5對U87細胞生物學活性的影響

3 討論

盡管GRK5在心血管疾病發病機制中的作用已經被廣泛研究，但直到近年來，它在腫瘤發生發展中的作用才逐漸被揭示。GRK5被認為在調節肺癌、前列腺癌等腫瘤細胞的生長中發揮作用，而在膠質瘤中的研究還相對較少。近期的研究[9]表明GRK5通過結合T66位點使Moesin磷酸化，從而對前列腺癌細胞中肌動蛋白的重塑、侵襲和轉移產生影響。而在GBM細胞中，Moesin是被磷酸化激活的主要ERM成員，在膠質瘤中的表達水平上調，并且與膠質瘤干細胞密切相關[12]。

本研究表明GRK5和Moesin均在GBM中高表達，課題組不僅觀察到GRK5、Moesin和CD44三者在GBM細胞膜上存在共表達，而且在腫瘤血管和膠質瘤壁龕結構大量富集分布，提示GRK5和Moesin可能參與構成膠質瘤的壁龕結構。GRK5-Moesin可能是GBMs維系膠質瘤干細胞“干性”的重要調節子。而調控GRK5可顯著改變Moesin表達，進一步提示GRK5-Moesin在膠質瘤中存在相互作用，GRK5作為上游基因，可靶向調控Moesin的表達活性。

GRK5+細胞和Moesin+細胞在膠質瘤各個血管周圍富集，但呈現出差異化分布特點。近年來有報道[13]提出，GBM生長需要不同的微循環模式，尤其是GBM細胞來源的血管(GBM cell-derived vessels，GDVs)。分析膠質瘤患者術后病理樣本發現，樣本中GDVs較多的患者的中位生存期僅為9.56個月，而GDVs較少的患者的中位生存期為13.60個月。那么，GRK5-Moesin與膠質瘤血管類型存在怎樣的關系，GRK5-Moesin差異化分布與膠質瘤內血管類型的關系有待進一步研究。

GRK5活性改變可影響膠質瘤細胞生物學活性。GRK5上調可促進膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲；GRK5上調/下調導致膠質瘤細胞凋亡率隨之減少/增加。目前已研制出針對GRK5的特異性靶向藥物：舒尼替尼(Sunitinib)是已被FDA批準的針對GRK5最有效的小分子抑制劑[14]，主要抑制血管內皮生長因子受體和血小板衍生生長因子受體，從而阻斷腫瘤的血管生成[15]。舒尼替尼能否通過靶向抑制GRK5使膠質瘤患者獲益還需繼續深入研究。