基于生物基質(zhì)碳點構(gòu)建熒光探針用于腌臘肉制品中亞硝酸鹽的檢測

黃 楊，高田毅，朱宏星，孫 沖, ，韓婷婷，王道營，徐為民,

（1.南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇南京 210023；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014；3.蘇州工業(yè)園區(qū)生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇蘇州 215123）

亞硝酸鹽（NO2-）是一種常見的食品添加劑，在腌肉制品、果醬、乳制品、肉脯等食品加工中具有廣泛的應(yīng)用[1]。亞硝酸鹽作為肉制品護色劑，可與肉品中的肌紅蛋白反應(yīng)生成亞硝基肌紅蛋白，從而賦予肉制品良好的色澤，同時增進肉的風味，還可抑制肉毒芽孢桿菌生長[2]。然而，長期過量攝入亞硝酸鹽會對人體健康造成損害，增加患高鐵血紅蛋白癥、胃癌、食管癌等疾病的風險[3]。目前，對于NO2-檢測分析的常見方法有離子色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、毛細管電泳法[6]和分光光度法[7]等，但這些方法存在前處理復雜、設(shè)備昂貴、檢測時間長、需要專業(yè)的技術(shù)人員操作、不適用大量現(xiàn)場分析的問題。因此，開發(fā)綠色環(huán)保、成本低廉、操作簡單且靈敏度高的新方法，對實際產(chǎn)業(yè)中檢測亞硝酸鹽具有重要意義。

近年來，納米材料因其擁有穩(wěn)定的物理化學性能、優(yōu)良的尺寸效應(yīng)和制備方法多樣性等優(yōu)點[8]，在生物學、食品、醫(yī)學和環(huán)境檢測[9-11]等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。碳量子點（Carbon quantum dots，CQDs）是一種尺寸小于10 nm 的新型納米材料，具有粒徑小、水溶性良好、光學性質(zhì)穩(wěn)定和生物相容性優(yōu)良等特點，因此CQDs 被認為是熒光探針的潛在替代材料[12-14]。生物基質(zhì)作為一種低成本、綠色無污染、可再生的自然資源，在CQDs 制備中已得到廣泛研究和應(yīng)用。

熒光分析法是一種新興的檢測方法。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，熒光探針具有簡單方便，成本低，特異性好，靈敏度高等特點[15-16]。Li 等[17]基于檸檬酸/乙二胺碳納米點開發(fā)熒光猝滅毛細管分析方法，實現(xiàn)了對食品和自然水中的亞硝酸鹽的檢測。Wang 等[18]通過沉淀法制備1-氨基芘納米顆粒，基于納米顆粒與亞硝酸鹽的重氮化反應(yīng)構(gòu)建熒光探針，并將其應(yīng)用水樣中亞硝酸鹽的分析，表現(xiàn)出良好的選擇性和穩(wěn)定性。盡管目前已報道多種熒光檢測亞硝酸鹽的分析方法，但大多來源于有機染料及化學原料，且合成過程較為繁瑣，因此開發(fā)綠色經(jīng)濟、簡單高效的熒光探針仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。

針對這種不足，本文以肉雞加工廢棄物雞爪外皮作為生物基質(zhì)碳源，采用一步水熱法制備了具有藍色熒光特性的CQDs，從而建立了一種綠色、安全、快速檢測亞硝酸鹽的新技術(shù)，同時為畜禽加工廢舊生物資源利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用雞爪外皮 收集于江蘇南京市孝陵衛(wèi)農(nóng)貿(mào)市場；腌肉制品（臘腸、臘肉及臘排） 購買于南京市孝陵衛(wèi)蘇果超市；亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鈉（NaNO3）、磷酸鈉（Na3PO4）、硫酸鈉（Na2SO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、乙酸鈉（CH3COONa）、草酸鈉（Na2C2O4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、四硼酸鈉（Na2B4O7） 均為分析純，西隴化工股份有限公司；焦磷酸鈉（Na4P2O7）、鎢酸鈉（Na2WO4）、碳酸鈉（Na2CO3）、氯化鐵（FeCl3·6H2O）、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、氯化銨（NH4Cl）、氯化銅（CuCl2·2H2O）、氯化鋇（BaCl2·2H2O）、氯化鋁（AlCl3·6H2O）、氯化鎂（MgCl2·6H2O）、氯化鐵（FeCl2·4H2O）、氯化鋰（LiCl）、氯化鈣（CaCl2·2H2O）、氯化鍶（SrCl2·6H2O）、氯化鈷（CoCl2）均為分析純 國藥集團試劑有限公司；實驗用水 為超純水，電阻率18.5 MΩ·cm-1。

JEM-2100F 場發(fā)射透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；Cary 5000 紫外可見吸收光譜儀 美國Varian 公司；Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀美國Thermo 公司；ESCALAB 250Xi X 射線光電子能譜儀、ICS1100 離子色譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；LS 55 熒光分光光度計 珀金埃爾默股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CQDs 的制備 參照Wang 等[19]的方法制備CQDs，略作修改。以雞爪外皮為碳源，采用一步水熱合成碳量子點熒光材料。具體步驟如下：雞爪外皮經(jīng)洗凈烘干后，用食品粉碎機打磨成粉末。稱取2.0 g雞爪外皮粉置于200 mL 的聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，加入100 mL 超純水，混勻后于200 ℃下水熱反應(yīng)10 h。待反應(yīng)釜冷卻至室溫，將反應(yīng)后得到的混合溶液轉(zhuǎn)移至離心管，在10000 r/min 下離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后置于1000 Da 的透析袋內(nèi)，室溫透析24 h。收集透析袋內(nèi)溶液凍干，將凍干后的絮狀物研磨得到的CQDs 粉末放置于干燥皿中保存。

1.2.2 CQDs 的表征

1.2.2.1 微觀結(jié)構(gòu)觀察 通過透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）和高分辨率透射電子顯微鏡（High resolution transmission electron microscopy，HR-TEM）觀察CQDs 形貌。將制備的CQDs 粉末超聲溶解，使納米顆粒均勻分散到超純水中，取稀釋好的樣品液滴至超薄碳膜網(wǎng)上，室溫下干燥后于場發(fā)射透射電子顯微鏡上觀察其形貌及晶格結(jié)構(gòu)。

1.2.2.2 紫外可見吸收光譜分析 稱取CQDs 粉末100 mg，用蒸餾水溶解定容至100 mL，獲得1 mg/mL的CQDs 水溶液作為樣品溶液。采用紫外可見吸收光譜儀（Ultraviolet-visible absorption spectroscopy，UV-vis）對CQDs 溶液進行掃描。以去離子水作為空白對照，掃描波長范圍為200～700 nm，掃描速度為600 nm/min。

1.2.2.3 傅里葉變換紅外光譜分析 采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析CQDs 表面基團。使用KBr 壓片法制備樣品，掃描范圍為500～4000 cm-1，分辨率為4.00 cm-1。

1.2.2.4 X-射線光電子能譜分析 采用X-射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）確定CQDs 表面元素組成、含量和化學鍵狀態(tài)。將CQDs 粉末固定到樣品臺上，使用單色X 射線源Al Kα 作為激發(fā)源，激發(fā)電壓為1487 eV，以測得結(jié)合能284 eV 的C 1s 進行校準。

1.2.2.5 熒光光譜分析 采用熒光光譜儀（Fluorescence Spectrometer）對CQDs 的熒光性質(zhì)進行分析。以1 mg/mL CQDs 水溶液作為樣品溶液，設(shè)定激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。固定激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長范圍380～600 nm 得到CQDs 的熒光發(fā)射光譜；固定發(fā)射波長450 nm，激發(fā)波長范圍280～430 nm 得到CQDs 的熒光激發(fā)光譜。

1.2.3 CQDs 熒光量子產(chǎn)率測定 熒光量子產(chǎn)量根據(jù)參比法[20]測定。以硫酸奎寧（熒光量子產(chǎn)率為0.54）作為參比標準物質(zhì)，測定CQDs 與硫酸奎寧在同一激發(fā)波長下的熒光發(fā)射峰面積及同一波長處的吸光度。代入下式：

式中：下標1 和2 分別代表待測樣品和標準物質(zhì)；Q 表示熒光量子產(chǎn)率（%）；S 表示熒光發(fā)射積分面積；A 為吸光度；η 為溶劑的折射率（蒸餾水為1.33）。

1.2.4 CQDs-Fe2+熒光探針檢測NO2-配制濃度為1、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μmol/L 的NO2-溶液，取400 μL 不同濃度的NO2-溶液和相同體積的1 mmol/L Fe2+溶液加入到1 mL 的1 mg/mL CQDs 溶液中，加入1.5 mL PBS（0.1 mol/L，pH3.0），100 W 超聲30 min 使其混合均勻，記錄熒光發(fā)射光譜。每個濃度梯度設(shè)置5次平行實驗。參數(shù)設(shè)置為：固定激發(fā)波長為370 nm，發(fā)射波長范圍為380～600 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。通過分析體系熒光猝滅值△F 與NO2-濃度之間的變化關(guān)系，得出線性方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.5 實際樣品分析 參照GB 5009.33-2016 對購買的腌臘肉制品進行前處理[21]。具體步驟如下：將腌臘肉制品用食品粉粹機制成勻漿，稱取試樣勻漿1 g，置于100 mL 離心管中，加入40 mL 水，超聲提取30 min，每隔5 min 振搖一次。于75 ℃水浴中放置5 min 后取出，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中定容。溶液經(jīng)濾紙過濾后，于1000 r/min 下離心15 min，將上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后作為樣品原液。每組樣品制備三組平行試樣，分別采用離子色譜法和CQDs-Fe2+熒光探針進行檢測，結(jié)果取平均值。向腌臘肉制品樣品原液中添加100 μmol/L 的NO2-，計算實際樣本中NO2-的加標回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復3～5次取平均值，采用IBM SPSS Statistics 25 進行單因素方差分析，結(jié)果采用 X±SD 表示。使用Origin8.5 軟件（OriginLab 公司）對數(shù)據(jù)進行圖譜繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 CQDs 的表征

采用場發(fā)射透射電子顯微鏡對CQDs 形貌進行觀察，如圖1所示，CQDs 為球形納米顆粒，尺寸均一，且具有良好的分散性。插圖HR-TEM 圖像顯示，CQDs 的面間距為0.22 nm，這屬于石墨的（100）衍射面，表明CQDs 對應(yīng)于sp2型石墨碳納米晶芯[22]。圖2 為紫外可見吸收光譜及熒光光譜圖。由圖2 中可知，在263 nm 處CQDs 有明顯紫外吸收峰，這是芳香（C-C） sp2雜化軌道典型的π→π*躍遷產(chǎn)生的[23]。CQDs 的熒光激發(fā)峰與發(fā)射峰呈現(xiàn)狹窄對稱的特征，說明CQDs粒徑尺寸均勻且分散性良好[24]。插圖表明合成的CQDs 水溶液在自然光下呈現(xiàn)淡黃色或接近無色（左），在365 nm 紫外燈照射下發(fā)射出強烈的藍色熒光（右）。以硫酸奎寧作為標準物測得CQDs熒光量子產(chǎn)率為8.23%，說明其具有良好的熒光性能。

圖1 CQDs 的透射電子顯微鏡圖Fig.1 TEM image of CQDs

圖2 CQDs 的紫外可見吸收光譜及熒光光譜圖Fig.2 UV-vis absorption and fluorescence spectra of the CQDs

采用傅里葉變換紅外光譜表征CQDs，結(jié)果如圖3所示，3285 cm-1處吸收峰歸因于O-H 和N-H基團的伸縮振動，2921 和2868 cm-1處是C-H 對稱伸縮振動[25]。1627、1519、1451、1242 和1087 cm-1附近的峰對應(yīng)著C=O、C=C、C-N-C、C-OH 和C-OC[26-28]。這些官能團使得CQDs 具有良好的水溶性，有望進一步擴展其應(yīng)用領(lǐng)域。

圖3 CQDs 的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectrum of the CQDs

通過XPS 表征CQDs 的元素組成、化合狀態(tài)和分子結(jié)構(gòu)。圖4A 為CQDs 的XPS 全掃描譜圖，圖中分布284、398 和531 eV 三個主要峰，對應(yīng)C、N和O 三個元素。根據(jù)峰面積計算CQDs 中C、N 和O 三個元素的相對含量，分別為63.82%、16.06%、20.12%。通過XPSPEAK 軟件進一步分析CQDs 表面基團信息。圖4B 表示CQDs 的C 1s 譜圖，284.3 eV處的峰歸屬于石墨碳[29]，284.8 eV 處的峰表示CN/C-O 鍵，285.8 eV 處的峰對應(yīng)C=N 或者C=O 鍵，287.6 eV 處的峰則對應(yīng)于HO-C=O 鍵[30]。N 1s 譜圖（圖4C）存在398.9 和399.8 eV 兩個峰，分別對應(yīng)C-N-C 鍵和N-H 官能團中的氮原子[31]。O 1s 譜圖如圖4D所示，圖中530.9、531.7、532.6 eV 三個特征峰對應(yīng)C=O、C-O-C、C-OH 鍵[32]。XPS 分析結(jié)果證明CQDs 中存在羥基、羧基和烷基等多種基團，與傅里葉變換紅外光譜結(jié)果一致。

圖4 CQDs 的X-射線光電子能譜Fig.4 XPS spectra of the CQDs

2.2 CQDs-Fe2+探針檢測NO2-機理研究

本實驗研究了CQDs 熒光探針對Fe3+、Na+、Cu2+、K+、NH4+、Ba2+、Al3+、Mg2+、Fe2+、Li+、Ca2+、Sr2+和Co2+13 種常見金屬陽離子的特異選擇性。根據(jù)相對熒光強度值F/F0（F 為添加1 mmol/L 不同金屬離子后熒光值，F(xiàn)0為未添加其他離子的熒光值）評價熒光探針選擇性。測試三次取平均值，由SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。由圖5可知，與其他金屬離子相比，添加Fe3+后的相對熒光強度為25.69%，而其他離子相對熒光強度在85.55%～101.66%范圍間。與空白組相比，僅有Fe3+與其具有顯著性差異（P＜0.05），說明Fe3+對CQDs 具有明顯的熒光猝滅作用。

圖5 CQDs 對常見金屬離子的選擇性Fig.5 Selectivity of CQDs toward common metal ions

如圖6所示，當僅存在NO2-或Fe2+時，CQDs 的熒光基本無變化。在NO2-和Fe2+同時存在時，F(xiàn)e2+因NO2-的氧化作用轉(zhuǎn)化為Fe3+，F(xiàn)e3+與CQDs 表面的羥基、羧基等形成鐵-羥基或鐵-羧基復合物從而導致CQDs 熒光猝滅[33]。檢測機制如圖7所示，CQDs與Fe2+混合后在370 nm 激發(fā)波長下仍然發(fā)出強烈的藍色熒光，加入NO2-后，F(xiàn)e2+轉(zhuǎn)化為Fe3+使得CQDs熒光強度值降低，由此可構(gòu)建CQDs-Fe2+探針實現(xiàn)對NO2-的間接檢測。

圖6 CQDs 與Fe2+、NO2-、Fe2+/NO2-的熒光發(fā)射光譜Fig.6 Fluorescence spectra of CQDs with Fe2+, NO2- and Fe2+/NO2-

圖7 CQDs-Fe2+檢測NO2-的機制Fig.7 Mechanism of NO2- detection by CQDs-Fe2+

2.3 CQDs-Fe2+探針參數(shù)優(yōu)化

為了更好地優(yōu)化CQDs-Fe2+探針對NO2-的檢測性能，對CQDs 的激發(fā)波長、緩沖液pH、反應(yīng)時間進行研究。圖8A 為CQDs 溶液在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜，由圖中可知，最大激發(fā)波長位于370 nm 左右。隨著激發(fā)波長的增加，最大發(fā)射峰熒光強度逐漸增強，當激發(fā)波長超過370 nm 后，熒光強度開始下降。圖8B 為熒光強度歸一化后的熒光發(fā)射光譜，由圖中可以看出，在300～450 nm 的激發(fā)波長范圍內(nèi)，CQDs 的熒光發(fā)射光譜表現(xiàn)出明顯的紅移現(xiàn)象。這種現(xiàn)象是由CQDs 的費米能級附近不同表面缺陷態(tài)的光學選擇引起的[34]。在不同的激發(fā)波長下，CQDs 表面相應(yīng)的發(fā)色基團將占據(jù)主導地位，產(chǎn)生依賴于激發(fā)波長的熒光[35]。說明該CQDs 具有激發(fā)波長的依賴性。當激發(fā)波長為370 nm CQDs熒光強度最強，最大發(fā)射波長在450 nm 處。故后續(xù)實驗所選激發(fā)波長為370 nm。

圖8 不同激發(fā)波長下CQDs 的熒光發(fā)射光譜（A）和歸一化發(fā)射光譜（B）Fig.8 Fluorescence emission spectra (A) and emission normalized spectra of CQDs (B) in different excitation wavelengths

圖9A 顯示了在不同pH 的緩沖液中NO2-添加前后CQDs-Fe2+體系的熒光強度。結(jié)果表明，當緩沖液pH 在1～7 范圍內(nèi)變化時，隨著pH 逐漸增加，CQDs-Fe2+與CQDs-Fe2+/NO2-兩者熒光強度逐漸增高，當pH 在4～7 變化時，體系熒光基本保持穩(wěn)定，這是因為過酸環(huán)境會導致CQDs 的表面基團發(fā)生質(zhì)子化從而引起體系熒光強度減弱。通過分析NO2-添加前后CQDs-Fe2+體系熒光猝滅程度（圖9B），可以發(fā)現(xiàn)，當pH 為2 和3 時，體系熒光猝滅程度最大，考慮到CQDs-Fe2+在pH 為3 時熒光強度遠大于pH 為2 時，因此選擇pH3 作為體系反應(yīng)的最佳緩沖條件。

圖9 pH 對體系熒光強度（A）和猝滅程度（B）的影響Fig.9 Influence of pH on the fluorescence intensity (A) and the quenching rates (B)

圖10是CQDs-Fe2+與NO2-反應(yīng)時間（0～75 min）的優(yōu)化。從圖中可以看出，隨著反應(yīng)時間的增加，體系熒光強度值逐漸降低并趨于穩(wěn)定，結(jié)合時間在40 min 后，熒光強度保持恒定，表明NO2-和Fe2+之間的氧化還原反應(yīng)以及產(chǎn)生的Fe3+對熒光的猝滅作用在40 min 內(nèi)達到動態(tài)平衡。因此在后續(xù)實驗中選擇40 min 作為NO2-加入CQDs-Fe2+體系的反應(yīng)時間。

圖10 反應(yīng)時間對CQDs-Fe2+/NO2-體系熒光強度的影響Fig.10 Influence of r eactiontime onthefluorescence intensity ofCQDs-Fe2+/NO2-

2.4 CQDs-Fe2+探針線性檢測NO2-

由圖11 的熒光光譜圖可以看出，在CQDs-Fe2+中加入NO2-后，體系熒光強度隨著NO2-濃度增加逐漸降低。以NO2-濃度為橫坐標，450 nm 處CQDs 熒光猝滅值（△F=F0–F，F(xiàn)0為空白對照組熒光值，F(xiàn) 為待測組熒光值）為縱坐標，在1～500 μmol/L 范圍內(nèi)，兩者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為△F=0.60c+1.01（R2=0.9979），檢出限為0.61 μmol/L。與表1 中已報道的NO2-檢測方法相比，本方法建立的熒光探針具有較寬的線性范圍和較低的檢測限。

圖11 不同濃度NO2-的CQDs-Fe2+/NO2-熒光光譜圖Fig.11 Fluorescence spectra of CQDs-Fe2+ with different concentrations ofNO2-

表1 不同方法檢測NO2-的比較Table 1 Comparison of methods for the NO2- detection

2.5 CQDs-Fe2+探針抗干擾分析

為考察CQDs 熒光探針在檢測NO2-時的抗干擾性，在相同實驗條件下，選擇500 μmol/L 的NO2-、HPO42-、H2PO4-、PO43-、HCO3-、C2O42-、CH3COO-、CO32-、SO42-、S2O32-、NO3-、WO42-、P2O74-等陰離子對CQDs-Fe2+熒光探針的抗干擾性能進行測試。如圖12所示，與空白組相比，NO2-對CQDs-Fe2+體系的熒光猝滅效果明顯，而其他相同濃度的陰離子則對CQDs 的熒光猝滅效應(yīng)較小，證明其他陰離子在該熒光探針用于檢測NO2-時的影響很小，即CQDs-Fe2+熒光探針在檢測NO2-時具有良好的抗干擾能力。

圖12 CQDs-Fe2+檢測NO2-的抗干擾性Fig.12 Anti-interference of CQDs-Fe2+ in detection of NO2-

2.6 實際樣品檢測

為評估所制備的 CQDs-Fe2+熒光探針用于NO2-檢測的實際應(yīng)用價值，以市售三種腌臘肉制品，臘腸、臘肉、臘排為樣品，對其中 NO2-含量進行加標回收試驗。測定結(jié)果如表 2所示。該熒光探針測得樣品中 NO2-的回收率為 98.61%～100.95%，RSD 均小于 5%，且與離子色譜得到的結(jié)果基本一致，表明本研究所制備的 CQDs 熒光探針可用于實際樣品中NO2-的檢測。

表2 實際樣品中NO2-的測定結(jié)果Table 2 Detection of NO2- in actual samples

3 結(jié)論

本文以生物基質(zhì)雞爪外皮為碳源，采用一步水熱法合成具有良好熒光特性的CQDs。基于Fe3+對CQDs 的熒光猝滅能力和NO2-可將Fe2+轉(zhuǎn)化為Fe3+的氧化能力，進而構(gòu)建了CQDs-Fe2+熒光探針用于NO2-的檢測。在1～500 μmol/L 范圍內(nèi)，NO2-濃度與探針熒光猝滅值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限為0.61 μmol/L。將其應(yīng)用于腌臘肉制品中亞硝酸鹽的檢測，結(jié)果表明，與離子色譜法相比，本方法具有更低的檢測限，適用于實際樣品中亞硝酸鹽的微量分析。

綜上，本方法構(gòu)建的熒光探針在實現(xiàn)禽肉加工廢棄物再利用的同時，開發(fā)了一種綠色安全、快速、高效檢測亞硝酸鹽的技術(shù)，具有良好的檢測性能與實際應(yīng)用價值。此外，由于基于熒光物質(zhì)建立的預測模型會因模型選擇、人員操作及計量方法的不同存在精度上的差異，因此尋求精度高、穩(wěn)定性好、適用范圍廣的亞硝酸鹽檢測方法有待更深一步的研究。