基于氣相色譜質(zhì)譜法測定茶葉中噠螨靈等9 種農(nóng)藥殘留量的測量不確定度評定

李 俊，蔡 滔，代虹鏡，蘇美丞，祝 愿，王 震,

（1.貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗室，貴州貴陽 550004；2.黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州都勻 558000）

茶葉是我國重要的農(nóng)產(chǎn)品之一，具有幾千年的生產(chǎn)歷史。茶葉生產(chǎn)和銷售拉動了內(nèi)需消費(fèi)，促進(jìn)了經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展[1]。農(nóng)藥在茶樹生產(chǎn)中具有防治病蟲害、提升產(chǎn)量和改善產(chǎn)品品質(zhì)等重要作用[2-5]，同時茶葉中農(nóng)藥殘留問題成為茶葉質(zhì)量安全關(guān)注的焦點(diǎn)之一[6]。為了保證茶葉質(zhì)量安全，靈敏、準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)必不可少[7-8]。2021 年9 月實(shí)施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[9]規(guī)定了茶葉中農(nóng)藥最大殘留限量有106 項限量要求，存在一個農(nóng)藥規(guī)定了幾種檢測方法的現(xiàn)象，比如噠螨靈、氯菊酯、氯唑磷等農(nóng)藥可采用GB/T 23200.113 或GB/T 23204-2008 方法檢測。

在檢驗檢測工作中，取樣的代表性、溶液的配制以及樣品處理過程等方面，都會導(dǎo)致檢測結(jié)果產(chǎn)生一定的不確定性，對檢測結(jié)果不能肯定的程度即為不確定度。不同方法引入的不確定度因方法差異而不同，為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信性，有必要采用適當(dāng)?shù)臋z測方法，并對其測量不確定度進(jìn)行合理評定[10-12]。測量不確定度是與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，代表檢測值的可信區(qū)間，是衡量實(shí)驗室檢測質(zhì)量的重要指標(biāo)，是實(shí)驗室提高檢驗結(jié)果可靠性的重要保障[13-16]；當(dāng)不確定度越小，檢測結(jié)果可信度越高；反之越低。通過不確定度來源分析和分量評定，掌握影響檢測質(zhì)量的關(guān)鍵步驟，從而可提高檢測實(shí)驗室的數(shù)據(jù)質(zhì)量[17-21]。

本研究分別采用國家標(biāo)準(zhǔn)《茶葉中519 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[22]和《植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》[23]方法定量檢測茶葉中噠螨靈等9 種農(nóng)藥殘留量，依據(jù)《測量不確定度評定與表示》[24]和《化學(xué)分析測量不確定度評定》[25]，分析評定兩個不同檢測方法檢測過程中各不確定度分量的來源，給出擴(kuò)展不確定度，以期為農(nóng)藥殘留檢測實(shí)驗室評定不確定度提供參考范例，為實(shí)驗室選擇更適應(yīng)的檢測方法，為檢測結(jié)果的合理判定提供科學(xué)依據(jù)[26-27]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、甲苯 色譜純，美國天地；氯化鈉、正己烷、乙酸乙酯 分析純，國藥集團(tuán)；PSA 吸附劑、C18 吸附劑、GCB 粉末 色譜純，美國安捷倫；固相萃取柱Cleanert TPT 10 mL 2.0 g Agela 公司；9 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：噠螨靈（pyridaben）、氟氯氰菊酯（Cyfluthrin）、甲拌磷（phorate）、甲基對硫磷（parathionmethy）、氯菊酯（Permethrin）、氯氰菊酯（Cypermethrin）、氯唑磷（isazofos）、氰戊菊酯（fenvalerate）、水胺硫磷（isocarbophos） 濃度均為1000 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心（天津）。

GC-MS/MS 聯(lián)用儀Trace GC Ultra-TSQ MS/MS美國賽黙飛世爾公司；IKA T18 高速勻漿機(jī) 德國IKA 公司；IKA VRTEX2 渦旋混合器 德國IKA公司；BUCHI R-200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI 實(shí)驗儀器公司；Organomation N-EVAP 美國OI 分析儀器公司；TSL-5-A 離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

1.2.1.1 單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制 準(zhǔn)確吸取9 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)溶液各1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用丙酮溶液稀釋到刻度，得到100.0 mg /L 標(biāo)準(zhǔn)單標(biāo)儲備液。

1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制 準(zhǔn)確吸取適量的100.0 mg/L 單標(biāo)儲備液于50 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋配制成2～4 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。內(nèi)標(biāo)物配制為10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.1.3 基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制 取不含待測物的茶葉樣品，按相應(yīng)的前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，準(zhǔn)確吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液和1 mL 內(nèi)標(biāo)于10 mL 容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液定容配制成所需的標(biāo)準(zhǔn)工作液。混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列配制見表1。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液Table 1 Preparation of mixed standard series solution

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 方法選擇 分別參照方法1：GB 23200.113-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》QuEChERS 部分；方法2：GB/T 23204-2008 《茶葉中519 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法》進(jìn)行樣品前處理。供試茶樣購置于市場，茶葉樣品粉碎后過60 目篩，待分析。

1.2.2.2 樣品提取 方法1：準(zhǔn)確稱取2 g 試樣（精確至0.01 g）于50 mL 塑料離心管中，加10 mL 水渦旋均勻，靜置30 min。加入15 mL 乙腈-醋酸溶液、6 g無水硫酸鎂、1.5 g 醋酸鈉及1 顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩提取1 min，4200 r/min 離心5 min，吸取8 mL上清液，待凈化。

方法2 ：準(zhǔn)確稱取5 g 試樣（精確至0.01 g），于80 mL 離心管中，加入15 mL 乙腈，15000 r/min 均質(zhì)提取1 min，4200 r/min 離心5 min，取上清液于200 mL雞心瓶中。殘渣用15 mL 乙腈重復(fù)提取一次，離心，合并二次提取液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL 左右，待凈化。

1.2.2.3 樣品凈化 方法1：吸取8 mL 上清液加到內(nèi)含1200 mg 硫酸鎂、400 mg PSA，400 mg C18及200 mg GCB 的15 mL 塑料離心管中，渦旋混勻1 min。4200 r/min 離心5 min，準(zhǔn)確吸取2 mL 上清液于10 mL 試管中，40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两伞＜尤?00 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，加入1 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，過微孔濾膜，待氣相色譜質(zhì)譜測定。

方法2：用10 mL 的v（乙腈）:v（甲苯）=3:1 混合洗液預(yù)洗Cleanert TPT 固相萃取柱（柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉），加入待凈化樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，用2 mL 混合洗液洗滌樣液瓶，重復(fù)三次，并將洗滌液移人柱中，再用25 mL 乙腈-甲苯洗滌小柱，收集上述所有流出液于雞心瓶中，40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL。加入5 mL 正己烷進(jìn)行溶劑交換，重復(fù)兩次，最后使樣液體積約為1 mL，加入100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，過微孔濾膜，待氣相色譜質(zhì)譜測定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 氣相色譜條件 方法1：色譜柱：DB-1701MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件為；程序升溫：初溫40 ℃，以40 ℃/min 升溫至120 ℃，再以5 ℃/min 升溫至240 ℃，再以12 ℃/min 升溫至300 ℃，保持6 min；載氣為He，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度（280.0 ℃）；進(jìn)樣量1.0 μL；不分流進(jìn)樣。方法2：色譜柱：DB-1701MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件為；程序升溫：初溫40 ℃，以30 ℃/min 升溫至130 ℃，再以5 ℃/min 升溫至250 ℃，再以10 ℃/min 升溫至300 ℃，保持5 min；載氣為He，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度（290.0 ℃）；進(jìn)樣量1.0 μL；不分流進(jìn)樣。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 方法1：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；氣相色譜-質(zhì)譜傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式掃描，碰撞反應(yīng)氣壓力（Ar，2×10-4kPa）；溶劑延遲3 min。

方法2：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；氣相色譜-質(zhì)譜傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；選擇性離子監(jiān)測（SIM）模式掃描；溶劑延遲5 min。

1.3 不確定度分析

1.3.1 數(shù)學(xué)模型的建立 根據(jù)GB/T 23200.113-2018和GB/T 23204-2008 方法（表2），茶葉中被測農(nóng)藥殘留含量（w）按式（1）計算：

表2 GB/T 23200.113-2018 與GB/T 23204-2008 標(biāo)準(zhǔn)比較Table 2 Comparison Table of GB/T 23200.113-2018 and GB/T 23204-2008 standards

式中：w：茶葉中被測農(nóng)藥殘留含量（mg/kg）；c：由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出測試樣液的濃度（mg/L）；v：樣液定容體積（mL）；m：樣品稱樣量（g）；f：稀釋因子（GB/T 23200.113-2018 為 7.5、GB/T 23204-2008為1.0）。

1.3.2 不確定度來源分析 按規(guī)范方法抽樣和制備樣品樣品均勻性引入的不確定度忽略不計[26]。從數(shù)學(xué)模型和測定過程可知，不確定度分量包括以下幾個方面：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其配制過程中引入的不確定度cs；內(nèi)標(biāo)物質(zhì)使用引入的不確定度csi；樣品稱量引入的不確定度m；前處理過程中液體體積量取引入的不確定度v；標(biāo)準(zhǔn)工作液測量不確定度（Rrec）；樣品溶液液中被測組分與內(nèi)標(biāo)峰面積比（Ai/Asi）；檢測回收率（Qrec）等方面；不確定度分量來源見圖1。

圖1 測量不確定度分量魚骨圖Fig.1 Fishbone diagram of measurement uncertainty component

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Excel2010 與SPSS22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入不確定度urel（c）

實(shí)驗室通常選擇購買100 或1000 mg/L 的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。通過配制成農(nóng)藥單標(biāo)儲備液、混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液、混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)工作測試液。每一步都會有不確定度的帶入，分析不確定帶入因子詳見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入不確定度Table 3 Introduction uncertainty of standard solution configuration

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入不確定度urel（c1） 本研究中噠螨靈、氟氯氰菊酯、甲拌磷等9 個標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度均為1000 mg/L，其擴(kuò)展不確定度[u95（c1）]為7 mg/L，包含因子（k）為2，則由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對不確定度urel（cs-1）為：

某品牌標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)廠家生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為1000 mg/L 時，其擴(kuò)展不確定度[u95（c1）]為20 mg/L，其引入的相對不確定度urel（c1）為1.41%。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入不確定度urel（c2） 實(shí)驗室儲備液的配制包括單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液和混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。先用1 mL A 級吸量管移取1.0 mL 1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 容量瓶中，用丙酮定容并配成100 mg/L 的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液。然后再分別吸取1 mL單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL 容量瓶中，用丙酮定容并配成2 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。過程中涉及溫度變化對試劑膨脹的影響、人員量取誤差及吸量管、容量瓶引入的不確定度。

丙酮膨脹引入分量，實(shí)驗室溫度通常為（20±5）℃，丙酮的膨脹系數(shù)為0.00143 ℃-1，由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的丙酮體積變化為：u（v丙酮）=±（0.00143 mL×5×v）=±0.00715×v mL，服從矩形分布，則溫度對丙酮體積變化的不確定度[urel（v丙酮）]為：

利用式（3）計算出標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制中，丙酮膨脹引入的不確定度[urel（v丙酮）]，為0.41%，引入4次。

人員吸量管使用量取誤差引入分量，采用統(tǒng)計方法評定不確定度，通過在重現(xiàn)性、重復(fù)性條件下使用同一吸量管，重復(fù)量取純水，利用電子天平測量，得到n=9次測量值（x），標(biāo)準(zhǔn)偏差s（x）利用貝塞爾式（4）計算，不確定度urel（x）按式（5）計算。

利用式（5）計算出標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制中，使用1 mL的A 級吸量管移取1.0 mL 樣液時引入的人員測量不確定度[urel（s1）]，為0.13%，對于每一個組分引入2次。

量具允許誤差引入分量：A 級1 mL 吸量管允許誤差為±0.008 mL[27]，滿足三角形分布，則由吸量管量取1.0 mL 溶液引入的不確定度[urel（v1）]為:

利用式（6）計算出標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制中，使用1 mL的A 級吸量管移取1.0 mL 樣液引入的不確定度[urel（v1）]，為0.33%，對于每一個組分引入2次。

A 級10、50 mL 容量瓶的允許誤差分別為±0.02 和±0.05 mL，讀數(shù)重復(fù)性偏差分別為±0.01和±0.025 mL，均服從三角形分布。利用（6）式計算，則由10 mL 容量瓶允許誤差帶來的不確定度[urel（v2）]為0.082 %和讀數(shù)誤差帶來的不確定度[urel（v3）]為0.041%；由25 mL 容量瓶允許誤差帶來的不確定度[urel（v4）]為0.041%和讀數(shù)誤差帶來的不確定度[urel（v5）]為0.020 %。

利用式（7）計算可得由標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制帶來的不確定度[urel（c2）]為0.97%。

2.1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入不確定度urel（c3）

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液是通過使用混合標(biāo)準(zhǔn)儲配液稀釋，本實(shí)驗中的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按表1 中濃度配制，分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL 容量瓶內(nèi)，加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，丙酮定容得到所需標(biāo)準(zhǔn)工作液。過程中涉及溫度變化對試劑膨脹的影響、人員量取誤差及吸量管、容量瓶引入的不確定度。標(biāo)液和樣液中內(nèi)標(biāo)物是采用同一瓶內(nèi)標(biāo)物質(zhì)添加，故不考慮內(nèi)標(biāo)物質(zhì)在配制過程中的不確定度的引入，僅考慮內(nèi)標(biāo)物添加時，體積引入的那部分不確定度。

丙酮膨脹引入分量，利用式（3）計算出標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制中，丙酮膨脹引入引入的不確定度[urel（v丙酮）]為0.41%，對每一個濃度點(diǎn)引入3次（標(biāo)液量取、內(nèi)標(biāo)量取、容量瓶定容）。

人員吸量管使用量取誤差引入分量，利用式（5）計算出標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制中，使用1 mL 的A 級吸量管移取0.5 mL 混合儲備液配制濃度點(diǎn)1 時引入的人員測量不確定度[urel（s1）]為0.14%。濃度點(diǎn)2時引入的人員測量不確定度[urel（s2）]為0.13%。濃度點(diǎn)3 時引入的人員測量不確定度[urel（s3）]為0.26%。濃度點(diǎn)4 時引入的人員測量不確定度[urel（s4）]為0.59%。濃度點(diǎn)5 時引入的人員測量不確定度[urel（s5）]為0.50%。濃度點(diǎn)6 時引入的人員測量不確定度[urel（s6）]為0.49%。濃度點(diǎn)7 時引入的人員測量不確定度[urel（s7）]為0.76%。使用1 mL 的A 級吸量管移取1.0 mL 內(nèi)標(biāo)溶液時引入的人員測量不確定度[urel（si）]為0.13%。

量具允許誤差引入分量，A 級1、2、5、10 mL 吸量管，A 級10 mL 容量瓶允許誤差與讀數(shù)重復(fù)性偏差引入不確定度。

A 級1、2、5、10 mL 吸量管，A 級10 mL 容量瓶的允許誤差分別為±0.008、±0.012、±0.025、±0.050、±0.02、讀數(shù)重復(fù)性偏差分別為±0.004、±0.006、±0.01、±0.025、±0.01mL。利用式（6）計算，濃度點(diǎn)1 使用A 級1 mL 吸量管吸取0.5 mL 混合標(biāo)液和1 mL 內(nèi)標(biāo)物，引入的不確定度[urel（v1）]：

A 級1 mL 吸量管允許誤差帶來的不確定度[[urel（v1-1）]為0.653%和讀數(shù)誤差帶來的不確定度[urel（v1-2）]為0.327%；10 mL 容量瓶帶來的不確定度[[urel（v1-3）]為0.082%和讀數(shù)誤差帶來的不確定度[urel（v1-4）]為0.041%；內(nèi)標(biāo)物對每個濃度點(diǎn)不確定度均為A 級1 mLA 級1 mL 吸量管允許誤差帶來的不確定度[[urel（v1-5）]為0.327%和讀數(shù)誤差帶來的不確定度[urel（v1-6）]為0.163%。按式（8）計算，濃度點(diǎn)1 引入的不確定度[urel（v1）]為0.822%。

利用式（8），計算其他濃度點(diǎn)不確定度[urel（v2）]為0.525、[urel（v3）]為0.466%、[urel（v4）]為0.525%、[urel（v5）]為0.450%、[urel（v6）]為0.436%、[urel（v7）]為0.473%。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液每個濃度點(diǎn)引入不確定度[urel（c3-x）]，利用式（9）計算出混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度點(diǎn)1[urel（c3-1）]不確定度為1.15%。

利用式（9），計算其他濃度點(diǎn)不確定度[urel（c3-2）]為0.902%，[urel（c3-3）]為0.898%，[urel（c3-4）]為1.07%，[urel（c3-5）]為0.987%，[urel（c3-6）]為0.975%。

利用式（10），計算可得由混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制帶來的不確定度[urel（c3）]為2.21%。

綜上，在標(biāo)準(zhǔn)品配制中，單標(biāo)儲備液、混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液、混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引起的合成不確定度[urel（c）]為：

利用式（11），計算可得標(biāo)準(zhǔn)溶液配制步驟帶來的不確定度[urel（c）]為2.46 %。

2.2 樣品前處理引入不確定度urel（P）

2.2.1 樣品質(zhì)量稱取引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m）

由天平允許誤差不確定度urel（m1）、天平示值誤差不確定度urel（m2）、稱量重復(fù)性不確定度urel（m3）引入。

方法1，采用百分之一天平稱取2 g 樣品，天平的允許誤差為0.01g、示值誤差為0.005 g，符合矩形分布，則天平允許誤差不確定度urel（m1）、天平示值誤差不確定度urel（m2）分別為：

稱樣重復(fù)性（n=9）,用標(biāo)準(zhǔn)偏差S（x）利用貝塞爾公式（4）計算，不確定度urel（m3）按公式（5）計算為1.07%。

利用式（14），計算可得方法1 由稱樣帶來的不確定度[urel（m）]為1.16 %，方法2 由稱樣帶來的不確定度[urel（m）]為1.10%。

2.2.2 樣品提取引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（v1）

樣品在提取、分取步驟過程中，方法1 僅考慮樣品提取引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（v1），由乙腈膨脹引入不確定度urel（v1-1）、吸量管引入不確定度urel（v1-2）、量取重復(fù)性引入不確定度urel（v1-3），吸取8 mL 上清液待凈化，體積不直接帶入不確定度，故不考慮不確定度引入。方法2 中提取液全部轉(zhuǎn)入雞心瓶40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL 左右，待凈化，無分取步驟，不考慮該步驟的不確定度引入。但無水硫酸鎂、醋酸鈉等試劑的多少、提取時間、均值轉(zhuǎn)速等因素帶入的不確定度均體現(xiàn)在樣品的加標(biāo)回收上，在后文回收率分量進(jìn)行評定。

提取步驟是用A 級25 mL 吸量管量取15 mL乙腈試劑。乙腈膨脹引入分量，實(shí)驗室溫度通常為（20±5）℃，乙腈的膨脹系數(shù)為0.00137 ℃-1，由溫度變化引起試劑膨脹帶來的不確定度服從矩形分布，不確定度[urel(v1-1）]為0.395。A 級25 mL 吸量管最大允許誤差±0.1 mL，讀數(shù)重復(fù)性偏差為±0.05 mL，量器量取偏差服從三角形分布，故25 mL 吸量管量取15 mL 乙腈，允許誤差和讀數(shù)重復(fù)性引起的不確定度分別為[urel（v1-2）]為0.272%、[urel（v1-3）]為0.136%。

利用式（15），計算可得方法1 由提取步驟帶來的不確定度[urel（v1）]為0.499%。

2.2.3 樣品凈化、定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（v2） 樣品凈化、定容步驟過程中，兩個方法的凈化過程，方法1 中各填料的稱取量、振動的頻率和時間、離心的轉(zhuǎn)速和時間、樣品定容等均不直接帶入不確定度，僅與量取2 mL 凈化后樣液和內(nèi)標(biāo)溶液的量取引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度[urel（v2）]；方法2 中洗液的量取、洗脫的速度、樣品定容等均不直接帶入不確定度，僅與內(nèi)標(biāo)溶液的量取有關(guān)；

凈化步驟，方法1 用A 級2 mL 吸量管分取2 mL凈化后樣液，再用100 μL 單通道移液器量取100 μL內(nèi)標(biāo)，約用1 mL 乙酸乙酯復(fù)溶，待測。

乙腈試劑膨脹引起的相對不確定度[urel（v2-1）]為0.395%，A 級2 mL 吸量管最大誤差為±0.012 mL，其相對不確定度[urel（v2-2）]為0.245%，讀數(shù)重復(fù)性偏差為土0.006 mL，其相對不確定度[urel（v2-3）]為0.122%。

丙酮試劑膨脹引起的相對不確定度[urel（v2-4）]為0.41%，A 型100 μL 單通道移液器最大誤差為±0.8 μL，其相對不確定度[urel（v2-5）]為0.327%。

利用式（16），計算可得方法1 由凈化步驟帶來的不確定度[urel（v2）]為0.711%，方法2 由凈化步驟帶來的不確定度[urel（v2）]為0.327%。

綜上，在樣品前處理中，提取液量取、分取、定容、內(nèi)標(biāo)量取引起的合成不確定度[urel（P）]為：

利用式（17），計算可得方法1 由樣品前處理步驟帶來的不確定度[urel（P）]為1.45 %，方法2 由樣品前處理步驟帶來的不確定度[urel（P）]為1.15%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度urel（R）

按1.2.3 配制好混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測，每個濃度點(diǎn)測量5次，標(biāo)準(zhǔn)溶液化合物與內(nèi)標(biāo)物濃度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比數(shù)據(jù)見表4。利用SPSS20.0 軟件對表中數(shù)據(jù)作最小二乘法線性回歸處理。擬合曲線和確定系數(shù)見表5。

表4 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線測量結(jié)果Table 4 Measurement results of pesticide standard curve

利用式（18）計算出標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線標(biāo)準(zhǔn)偏差SA，yi為第i次測量的溶液化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比；a 為截距；b 為斜率；xi為第i次測量的標(biāo)準(zhǔn)溶液化合物與內(nèi)標(biāo)物濃度比；n 為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定總次數(shù)（n=30）。線性關(guān)系及擬合曲線的確定系數(shù)見表5。

利用式（19）計算擬合曲線引入的不確定度U（R）。SA為準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；p 為樣品的測定次數(shù)（p=10）；n 為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定總次數(shù)（n=30）；b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣品溶液濃度平均值（見表5）；為各標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度的平均值，為0.517 mg/L；xi為第i次測量的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度為A 類評定，樣液測定濃度在0.17～0.235 mg/L，每個樣品重復(fù)10次測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度和相對相對不確定度計算結(jié)果見表5。由結(jié)果可知氯氰菊酯在測定濃度為0.172 mg/L 時，引入測量不確定度為7.93 %，水胺硫磷、氯唑磷、甲基對硫磷引入測量不確定度均大于5.0%。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 5 Relative standard uncertainty introduced by the standard curves

假設(shè)1：在同一條件下測定同一樣品n次，考察了測量次數(shù)與不確定度的關(guān)系，利用測量次數(shù)和相對不確定度作圖2。隨著測量次數(shù)的增加，樣品測量由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度降低，樣品測量次數(shù)在3～4次時，不確定度的變化不明顯。結(jié)果說明，在檢測工作中，測量結(jié)果如出現(xiàn)陽性檢出時，樣品需要平行測量3次以上才能得到較可靠的結(jié)果。

圖2 樣液測量次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入相對不確定度的關(guān)系Fig.2 Relationship of the relative uncertainty resulting from the measurement times of the sample liquid and the fitting of the standard curve

假設(shè)2：在同一條件下測定不同陽性樣品，每個樣品重復(fù)10次，考察了測量不同樣液檢出濃度（0.05～1 mg/L）與不確定度的關(guān)系，利用測量濃度和相對不確定度作圖3，隨著檢測濃度的增加，標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對不確定度urel（R）降低，當(dāng)樣液測定濃度為0.3 mg/L 時，各化合物urel（R）均小于5.0%，但樣液測定濃度為0.05 mg/L 時，由各化合物urel（R）相對較高。并不是樣液測定濃度越高測定結(jié)果越可靠，當(dāng)樣液濃度繼續(xù)升高，設(shè)備單位檢測靈敏性會下降或者檢測器出現(xiàn)過載，樣液濃度和檢測器信號成下拋弧線，造成測量結(jié)果偏低的風(fēng)險。

圖3 樣液檢出濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入相對不確定度的關(guān)系Fig.3 Relationship of the relative uncertainty introduced by the detected concentration of the sample solution and the standard curve fitting

結(jié)果說明，在測定中，樣液測定濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線平均濃度附近時，檢測結(jié)果較可靠，不同濃度的樣品要使用合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量或者通過樣品稀釋、濃縮等方式讓樣液檢測濃度在合適的范圍內(nèi)進(jìn)行測定。

2.4 樣液峰面積測定重復(fù)性引入的不確定度urel（A）

方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，進(jìn)樣量的體積誤差不會對檢測帶來測量不確定度，主要考慮儀器對各組分的測量穩(wěn)定性，分析各目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值的測量偏差，用來評定儀器測量重復(fù)性引入的不確定度的程度。

茶葉樣品經(jīng)過1.3 步驟處理成樣液后，添加加入一定量農(nóng)藥成分，制備成模擬陽性檢樣品，上機(jī)樣液溶度為0.1～0.3 mg/L 為宜，采用統(tǒng)計方法評定不確定度，通過在重現(xiàn)性、重復(fù)性條件下，連續(xù)重復(fù)測試農(nóng)藥分面積與內(nèi)標(biāo)物分面積比10次，利用貝塞爾式（4）計算出峰面積比標(biāo)準(zhǔn)偏差S（A）、式（5）計算出不確定度urel（A），結(jié)果見表6。

表6 樣品溶液峰面積測定重復(fù)性引入的不確定度Urel（A） （n=10）Table 6 Uncertainty Urel (A) of repetitive ability (n=10)

結(jié)果可知，甲拌磷、氯唑磷等9 個農(nóng)藥由樣品溶液峰面積測定重復(fù)性引入的不確定度為0.5%～2.56%，其中菊酯類農(nóng)藥引入不確定度較大，氯氰菊酯引入的不確定度達(dá)2.56%。分析可知峰面積測定重復(fù)性引入的不確定度主要和儀器的穩(wěn)定性、靈敏度有關(guān)，也和農(nóng)藥的自身性質(zhì)有關(guān)。比如氯唑磷和水胺硫磷這兩個農(nóng)藥的穩(wěn)定性不如其他農(nóng)藥，在檢測分析中容易發(fā)生分解，增加了不確定度的引入；再比如氯氰菊酯、氰戊菊酯等菊酯存在異構(gòu)體，工作站對異構(gòu)體積分計算峰面積加和時也會引入不確定度；儀器的狀態(tài)，如進(jìn)樣口襯管、色譜柱柱效、離子源污染程度都會引起峰面積的測量不確定度的增加。

2.5 檢測回收率urel（Q）

添加回收率引入不確定度為A 類評定，采用在茶葉中分別加入濃度為方法1（0.10、0.20、0.50 mg/kg），方法2（0.02 、0.05 、0.10 mg/kg）的目標(biāo)分析物，每個添加水平重復(fù)6次。為扣除標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶入的不確定度，采取使用標(biāo)準(zhǔn)曲線上濃度值較接近點(diǎn)濃度單點(diǎn)定量，計算回收率，結(jié)果見表7。

表7 回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 7 Relative standard uncertainty introduced in the recovery rate

利用式（21）計算回收率引入的相對不確定度[urel（Q）]，式中n 為回收率獨(dú)立樣本個數(shù)18，S（Q）為回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差為回收率平均值。按式（22）對上述結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗，在95%置信區(qū)間，自由度為17 時，t分布臨界值t0.95（17）=2.110，當(dāng)檢驗值t≥2.110 時，則與回收率有顯著性差異，需要使用回收率修正結(jié)果，反之不需要[20]。

2.6 相對不確定度的合成

統(tǒng)計上述各不確定度分量，結(jié)果見表8～表9，各農(nóng)藥的合成相對不確定度urel（X）由各分量相對不確定度按公式（23）計算合成而得，結(jié)果見表8。

由表8～表9可知，兩個方法的合成不確定度引入量有差異，其中B 類不確定度分量中，由于前處理不同而引入不同量，A 類不確定度分量中主要是方法的原理不一樣，由于方法中農(nóng)藥的提取效率，基質(zhì)影響等因素造成回收率引入不確定度的差異。

表8 B 類評定不確定度的構(gòu)成Table 8 Composition of class B

表9 A 類評定不確定度的構(gòu)成和合成相對不確定度Table 9 Composition and synthesis of class A

從整個合成不確定度過程分析來看，各分量合成不確定度貢獻(xiàn)最大的是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度、回收率引入不確定度和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入；標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入不確定度分量主要為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入引起，標(biāo)準(zhǔn)品的配制過程不容忽視；通過測算，樣液的測量濃度很低時，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入貢獻(xiàn)很大；回收率引入不確定度最為重要，它也是我們在日常檢測工作的質(zhì)控手段之一，通過它的值來評價方法的準(zhǔn)確度，回收率的好壞受方法原理、農(nóng)藥性質(zhì)、人員操作、試劑耗材等多方面的影響。農(nóng)藥殘留檢測值即使不折算回收率，其對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度也存在影響，原因是回收率折算的是平均殘留值，但其對檢測結(jié)果的偏差無法被忽略[19]。

2.7 不確定度的表示

根據(jù)測量不確定度評定指南要求，在95%置信水平時，取子k=2，在0.15 mg/kg 添加水平下，每個水平重復(fù)6次，當(dāng)回收率在滿足方法要求時，各農(nóng)藥在茶葉樣品中的擴(kuò)展不確定度[28]，見表10。

表10 茶葉中9 種農(nóng)藥殘留的檢測結(jié)果不確定度Table 10 Uncertainty of 9 pesticide residues in tea leaves

2.8 實(shí)際樣品分析中不確定度評定

在實(shí)際樣品檢測中，對于農(nóng)藥殘留值為最大允許殘留值附近時，測量不確定的正確引入可決定該樣品是否超標(biāo)，這對實(shí)驗室和企業(yè)都非常重要。在分析檢測中，方法GB/T 23204-2008 和方法GB/T 23200.113-2018 都為茶葉中農(nóng)藥殘留檢測的推薦方法，方法的選擇可能會影響檢測結(jié)論。GB/T 23200.113-2018 由于具有簡單、快速、高效且成本低的特點(diǎn)，廣泛被作為實(shí)驗室的第一方法來使用，由表11可知，由于方法的稀釋倍數(shù)為7.5，甲拌磷、氯唑磷、甲基對硫磷、氰戊菊酯5 個農(nóng)藥，如果檢出濃度為MRLs時，樣液的理論檢測濃度在0.027 mg/L 以下，最低至0.0027 mg/L，在實(shí)際檢測分析中，由于儀器靈敏度和回收率的影響，樣品檢測結(jié)果的不確定度很大，對檢測結(jié)果的判定存在很大的風(fēng)險，建議這5 個藥使用GB/T 23204-2008 檢測分析。

表11 方法GB/T23204 和方法GB/T 23200.113-2018 比較Table 11 Comparison of method GB/T23204 and the method GB/T 23200.113-2018

噠螨靈、氯菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯在GB 2763-2021 食品中農(nóng)藥最大殘留限量上的允許最大殘留較高，分別為5、20、20、1 mg/kg。較高濃度的樣液進(jìn)入儀器后會造成色譜柱的過載、檢測器過載，產(chǎn)生測量誤差，建議使用GB/T 23200.113-2018 方法，同時采用增加乙酸乙酯的復(fù)溶體積和內(nèi)標(biāo)物的添加量，控制內(nèi)標(biāo)物濃度和標(biāo)液中內(nèi)標(biāo)物濃度基本一致為宜。

3 討論

通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，采用不同方法分析評估茶葉中噠螨靈等9 種農(nóng)藥殘留含量測定過程中的不確定度，實(shí)驗過程中對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制、樣品稱量、樣品提取、凈化、測量等過程會引入不確定度進(jìn)行分析，分析評定合成不確定度過程，可知不確定度貢獻(xiàn)主要來自標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品添加回收率和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，對實(shí)驗結(jié)果的影響較大，其次是樣品測量重復(fù)性，在極低測量濃度時，影響最為明顯。

在分析檢測中，方法GB/T 23204-2008 和方法GB/T 23200.113-2018 都為茶葉中噠螨靈等9 種農(nóng)藥殘留檢測的推薦方法，方法的選擇可能會影響檢測結(jié)論。建議甲拌磷、氯唑磷、甲基對硫磷、氰戊菊酯5 個農(nóng)藥，使用GB/T 23204-2008 檢測分析；噠螨靈、氯菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊4 個農(nóng)藥，使用GB/T 23200.1134-2018 檢測分析。可通過方法優(yōu)化，調(diào)節(jié)合適的檢測濃度，如：茶葉中氰戊菊酯和氯唑磷在MRLs 值檢出時，可適當(dāng)增加樣品稱樣量或減少定容液體積；氯菊酯和氯氰菊酯在MRLs 值檢出時，可增加提取液的體積和增加定容液體積。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度大小與樣品測量次數(shù)呈相關(guān)性，隨著測量次數(shù)的增加，樣品測量由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度降低，樣品測量次數(shù)在3～4次時，不確定度的變化不明顯。結(jié)果說明，檢測工作中，測量結(jié)果如出現(xiàn)陽性檢出時，樣品需要復(fù)測3次以上計算平均值才能得到較可靠的結(jié)果。測定中，樣液測定濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線平均濃度附近時，檢測結(jié)果較可靠，不同濃度的樣品要使用合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量或者通過樣品稀釋、濃縮等方式讓樣液檢測濃度在合適的范圍內(nèi)進(jìn)行測定。結(jié)果表明，選擇合適的校準(zhǔn)曲線和增加樣品的測量次數(shù)，可以降低標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度影響。

回收率引入不確定度最為重要，它也是我們在日常檢測工作的質(zhì)控手段之一，通過它的值能夠評價方法的準(zhǔn)確度。回收率的好壞受方法原理、農(nóng)藥性質(zhì)、樣品基質(zhì)、人員操作、試劑耗材等多因素干擾，造成測量結(jié)果不確定度數(shù)值增大。

4 結(jié)論

在采用氣相色譜質(zhì)譜法測定茶葉中的農(nóng)藥殘留量時，需要選擇合適的前處理方法，保障實(shí)驗室溫濕度環(huán)境條件，提高實(shí)驗人員的操作水平，使用滿足實(shí)驗需要的量具精度，試劑耗材的純度，做好儀器調(diào)試準(zhǔn)備工作，以滿足檢驗檢測的需求。樣品前處理中應(yīng)嚴(yán)格控制的各個步驟，操作精確，減少樣品稱樣量、提取液體積、定容溶液體積等引入的不確定度。使用合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)范圍，在定量軟件中調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)的權(quán)重，獲得更好的擬合結(jié)果，提高在MRL 值附近的測量準(zhǔn)確度。測量結(jié)果如出現(xiàn)陽性檢出時，樣品需要復(fù)測3次以上計算平均值才能得到較可靠的結(jié)果，從而降低測定結(jié)果的不確定度，確保檢測結(jié)果的置信度。