基于水蒸氣蒸餾法的獅頭柑精油提取工藝優化及成分分析

宋 雪，王增斌，包俊文，龐同匯，魯周民

（西北農林科技大學林學院，陜西楊凌 712100）

植物精油是從植物的花、葉、果實等部位提取的一類次生代謝產物[1]。研究表明植物精油具有抑菌[2]、消炎[3]、抗氧化[4]、減肥[5]、鎮痛[6]、抗癌[7]、殺蟲[8]、改善高膽固醇血癥和肝脂肪變性[9]等作用。植物精油提取及應用已成為目前研究的熱點。精油的提取方法有壓榨法[10]、水蒸氣蒸餾法[11]、有機溶劑萃取法[12]、超臨界CO2萃取法[13]及亞臨界流體萃取法[14]等。壓榨法操作周期長、出油率低，有機溶劑萃取法雖然提取率較高、但有機溶劑與精油難分離，超臨界CO2萃取法及亞臨界流體萃取法成本高。水蒸氣蒸餾法具有成本低、水油易分離、簡便無污染等優點，廣泛用于橘皮[15]、肉桂[16]、玫瑰[17]等植物精油提取。獅頭柑（Citrus reticulataBlanco cv. Manau Gan）屬于蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus），為陜西安康特有經濟林果樹[18]。獅頭柑因果面粗糙，形似獅子頭而得名[19]，其果實個大、皮肉不粘連易剝離，果肉汁多渣少、酸甜適中、后味微苦，具有清熱解毒、降火明目、止咳生津等多種保健作用。據西北農林科技大學農科院校區測試中心對獅頭柑果實檢測報告顯示，獅頭柑果實含蛋白質0.95%，VC0.12 mg/100 g，含鈣（Ca）147.4 mg/kg，含磷（P）166.9 mg/kg，含鐵（Fe）2.31 mg/kg，未檢出砷、鉛、汞等12 種有毒物質，具有很高的營養價值[20]。前期研究表明，獅頭柑具有和其他柑橘完全不同的香味[21]。目前，有關獅頭柑研究報道主要有以獅頭柑皮為原料的果醬加工工藝[22]，超聲輔助有機溶劑萃取獅頭柑精油[23]，獅頭柑果皮總黃酮提取工藝優化[24]，獅頭柑籽油的提取工藝優化及脂肪酸組分分析[25]等，水蒸氣蒸餾法提取獅頭柑精油鮮見報道。本研究以獅頭柑果皮鮮樣為原料，首先對水蒸氣蒸餾設備進行優選，在單因素實驗的基礎上對水蒸氣蒸餾工藝進行響應面優化，并對精油成分進行分析，旨在為獅頭柑及其他柑橘果皮精油的提取與利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獅頭柑 采摘自西北農林科技大學安康北亞熱帶經濟林果樹試驗示范站；液氮 楊凌液氮服務配送中心。

BCD-215DC 型冰箱 中國海爾集團；R200D型電子分析天平 精度0.0001，德國Sartorious 公司；KH-500DE 型數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；1310GC-MS 聯用儀（四極桿質量分析器，電子電離源和化學電離源） 美國賽默飛世爾科技有限公司；佳聲800C 多功能粉碎機 永康市紅太陽機電有限公司；1.5 L 蒸餾鍋 麗水市玖亞商貿有限公司；可調式電熱套 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 獅頭柑鮮果皮樣品的制備 選用果形飽滿、成熟度一致、無病蟲害和機械損傷的獅頭柑，其鮮果皮經多功能粉碎機加液氮冷凍研磨一定時間得到果皮樣品。

1.2.2 獅頭柑鮮果皮精油的制備 采用水蒸氣蒸餾法[26]提取精油，取果皮樣于500 mL 蒸餾瓶中，加入一定比例蒸餾水并進行超聲輔助處理后，加入兩粒沸石進行蒸餾提取一定時間，收集精油并稱量，計算得率Y，每個處理3次重復。計算公式為：

式中：Y 表示精油得率，%；M1為提取后精油的質量，g；M2為經過處理之后的獅頭柑樣品質量，g。

1.2.3 水蒸氣蒸餾提取設備優選 準確稱取30 g 獅頭柑果皮樣品4 份，按照料液比1:8（g/mL）加入蒸餾水于燒瓶中，在超聲功率80 W、超聲溫度40 ℃、超聲處理30 min，分別使用如圖1所示的4 種水蒸氣蒸餾設備蒸餾提取2 h，稱量精油質量，計算得率Y。

圖1 4 種不同的水蒸氣設備Fig.1 Four different steam equipment

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 研磨時間對獅頭柑精油得率的影響 固定料液比1:8（g/mL）、超聲功率80 W、超聲溫度40 ℃、超聲處理30 min、蒸餾時間2 h，分別考察獅頭柑鮮果皮樣品經冷凍研磨10、15、20、25、30 s 后對精油得率的影響，按照1.2.2 工藝流程制備獅頭柑鮮果皮精油，并計算得率Y。

1.2.4.2 料液比對獅頭柑精油得率的影響 固定冷凍研磨25 s、超聲功率80 W、超聲溫度40 ℃、超聲處理30 min、蒸餾時間2 h，分別考察料液比1:6、1:7、1:8、1:9、1:10（g/mL）對精油得率的影響，按照1.2.2 工藝流程制備獅頭柑鮮果皮精油，并計算得率Y。

1.2.4.3 蒸餾時間對獅頭柑精油得率的影響 固定冷凍研磨25 s、料液比1:8 （g/mL）、超聲功率80 W、超聲溫度40 ℃、超聲處理30 min，分別考察蒸餾時間1、1.5、2、2.5、3 h 對精油得率的影響，按照1.2.2工藝流程制備獅頭柑鮮果皮精油，并計算得率Y。

1.2.4.4 超聲溫度對獅頭柑精油得率的影響 固定冷凍研磨25 s、料液比1:8（g/mL）、超聲功率80 W、超聲處理30 min、蒸餾時間2 h，分別考察超聲溫度20、30、40、50、60 ℃對精油得率的影響，按照1.2.2工藝流程制備獅頭柑鮮果皮精油，并計算得率Y。

1.2.4.5 超聲功率對獅頭柑精油得率的影響 固定冷凍研磨25 s、料液比1:8 （g/mL）、超聲溫度40 ℃、超聲處理30 min、蒸餾時間2 h，分別考察超聲功率60、70、80、90、100 W 對精油得率的影響，按照1.2.2工藝流程制備獅頭柑鮮果皮精油，并計算得率Y。

1.2.4.6 超聲時間對獅頭柑精油得率的影響 固定冷凍研磨25 s、料液比1:8 （g/mL）、超聲功率80 W、超聲溫度40 ℃、超聲處理30 min、蒸餾時間2 h，分別考察超聲時間10、20、30、40、50 min 對精油得率的影響，按照1.2.2工藝流程制備獅頭柑鮮果皮精油，并計算得率Y。

1.2.5 響應面優化試驗 在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken 試驗設計對超聲溫度、超聲功率和超聲時間3 因素進行響應面優化設計。試驗設計見表1。

表1 獅頭柑精油提取試驗因素水平設計Table 1 Factors level of essential oil extraction test of Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

1.2.6 獅頭柑鮮果皮精油成分測定 將提取的獅頭柑精油用正己烷稀釋1000 倍后，吸取1 mL 加入進樣瓶中進行GC-MS 分析[27]。

氣相色譜條件：色譜柱：TG-5MS 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升溫，初始柱溫為50 ℃，保持1 min，以3.0 ℃/min 升溫至130 ℃，保持1 min，以2 ℃/min 升溫至150 ℃，保留1 min，以10 ℃/min 升溫至280 ℃，保持5 min，載氣為高純氦氣，流速1.000 mL/min，進樣口溫度250 ℃，進樣量0.2 μL，分流比40:1。

質譜條件：離子源為EI，電子能量70 eV，接口和離子源的溫度分別為280 和270 ℃，掃描范圍：40～460 aum。

1.3 數據處理

利用Excel 對數據進行分析與統計；采用Origin 2021 b 進行制圖；SPSS 25.0 進行單因素方差分析；Design-Expert V 10.0.1 進行響應面試驗設計；所得質譜圖運用計算機Xcalibur 系統NIST2014 譜庫自動檢索，僅報道SI 和RSI 均大于800 的鑒定結果，面積歸一化法計算各組分相對含量；數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 水蒸氣提取設備選擇結果

4 種水蒸氣蒸餾設備提取獅頭柑精油結果如圖2所示。由圖2可知，所選4 種水蒸氣蒸餾設備提取精油的得率由高及低依次為：II（Clevenger 揮發油蒸餾儀）＞III（恒壓萃取水油分離器）＞I（普通水蒸氣設備）＞IV（蒸餾鍋提取設備）。普通水蒸氣蒸餾設備和蒸餾鍋提取設備在蒸餾過程中提取物一直暴露在外界空氣中，精油揮發較多，而恒壓萃取水油分離器的提取物處于較為密閉的環境，但三者收集到的精油均需要通過分液漏斗進行進一步分離，在此過程會造成精油損失；Clevenger 揮發油蒸餾儀具有密閉性好，蒸餾過程中自動進行水油分離的優點，并且價格較其他設備更有優勢，故選用Clevenger 揮發油蒸餾儀作為后續試驗的提取設備。

圖2 不同水蒸氣設備對獅頭柑精油得率的影響Fig.2 Effects of different steam equipment on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 研磨時間對獅頭柑精油得率的影響 隨著獅頭柑研磨時間的增加，獅頭柑精油得率呈先上升后下降趨勢，在25 s 處達最大值2.03%±0.02%，如圖3所示。研磨時間太短，物料粒徑過大，表面油囊未破壞完全，揮發油未能充分釋放，導致得率低；當研磨時間不斷增長，根據擴散定律[28]，粉碎度越高，粒徑越小，與水蒸氣接觸面積越大，越有助于揮發油提取，獅頭柑得率就越高；但當物料顆粒度過細，顆粒容易吸附一部分精油，揮發油阻力增大，使得率降低。因此選擇研磨時間25 s。

圖3 研磨時間對獅頭柑精油得率的影響Fig.3 Effect of grinding time on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.2 料液比對獅頭柑精油得率的影響 隨著料液比的增加，獅頭柑精油得率呈現先上升后下降趨勢，當料液比達到1:8（g/mL）時精油得率達到最大為2.27%±0.03%，當料液比超過1:8（g/mL）時精油得率不斷降低趨于平衡，如圖4所示。加水量較低，獅頭柑樣品不能充分和溶劑結合，得率低，并容易導致糊化。隨著料液比增加，物料與水充分融合，接觸面積加大，擴散速度提高，得率也相應提高。當料液比過大時，雖然揮發油充分釋放，但總量不再增加，在水中溶解度也相應提高，于溶劑中損失的量增加，故最終的揮發油得率降低[29]。因此料液比選取1:8 （g/mL）。

圖4 料液比對獅頭柑精油得率的影響Fig.4 Influence of solid-liquid ratio on extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.3 蒸餾時間對獅頭柑精油得率的影響 獅頭柑精油得率隨蒸餾時間呈先上升后緩慢下降趨勢，在蒸餾時間2.5 h 時精油得率高達2.32%±0.03%，如圖5所示。蒸餾2.5 h 能夠使獅頭柑果皮中的精油最大限度的提取出來，精油基本提取完成。提取時間過長，精油得率稍微有所下降，是因為長時間的提取，造成精油中部分化學性質發生變化破壞，導致得率降低[30]。因此蒸餾時間選取2.5 h。

圖5 蒸餾時間對獅頭柑精油得率的影響Fig.5 Effect of distill time on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.4 超聲溫度對獅頭柑精油得率的影響 獅頭柑精油得率隨超聲溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，如圖6所示，由于獅頭柑精油的溶出需要一定的溫度條件，溫度上升可加快分子運動，動能增大，獅頭柑精油得率呈現上升趨勢，在30 ℃達到最大值2.26%±0.03%。在30 ℃之后，得率呈現下降狀態，原因是高溫導致獅頭柑精油成分降解、熱敏性物質的氧化[31]。

圖6 超聲溫度對獅頭柑精油得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.5 超聲功率對獅頭柑精油得率的影響 圖7 為超聲功率對獅頭柑精油得率的影響，獅頭柑精油得率隨超聲功率的增加呈現先增加后降低的趨勢，在超聲功率達到80 W 時得率達到最大值2.46%±0.03%。其原因可能是超聲波的空化作用形成高溫高壓環境，增加水分子穿透力，加速精油進入水蒸氣中，提高精油得率[32]；隨著超聲波功率的增大，對細胞壁的破碎作用增強，破壞細胞類物質結構[33]；較高的超聲波直接導致精油的分解，導致得率降低[34]；另一方面，超聲波的除氣效果可能是造成部分精油的流失。

圖7 超聲功率對獅頭柑精油得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.2.6 超聲時間對獅頭柑精油得率的影響 隨著超聲時間的延長，獅頭柑精油的得率呈現先上升后下降趨勢，在30 min 時達到最大，為2.36%±0.03%。如圖8所示，當超聲時間在10～30 min 時，精油得率隨時間延長呈上升趨勢，這可能是因為超聲波的作用加劇了細胞破碎度，利于獅頭柑精油在溶劑中的溶出，提高了得率[35]。在超聲時間超過30 min 后，得率呈現下降狀態，可能是因為超聲時間增加，熱敏性提高，導致獅頭柑精油中的某些物質分解和揮發，也可能由于物料中一些水溶性雜質溶解于水中，增加了提取溶液的濃度，降低了精油在蒸汽中的得率，使得精油得率降低[36]。

圖8 超聲時間對獅頭柑精油得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of essential oil from Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.3 響應面優化結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果 綜合單因素實驗結果，考慮到超聲輔助處理對獅頭柑精油的提取有較大影響，因此固定研磨時間、料液比和蒸餾時間，選擇超聲溫度（A）、超聲功率（B）和超聲時間（C）三個因素，獅頭柑精油得率（Y）為響應值，采用Box-Behnken中心組合試驗原理設計三因素三水平試驗優化獅頭柑精油提取條件。響應面試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results

2.3.2 回歸模型的建立與分析 應用Design-Expert V 10.0.1 軟件對表2 中的獅頭柑精油得率Y 結果進行響應面回歸擬合分析，所建立的二次回歸模型為：

Y=2.47+0.11A+0.15B+0.047C+0.030AB-0.010AC+0.070BC-0.16A2-0.22B2-0.17C2，對此模型進行顯著性分析，結果見表3。

表3 回歸模型顯著性分析結果Table 3 Significance analysis results of regression model

由表3可知，回歸模型的F值為98.28，P值＜0.01，表明模型顯著，失擬項P值=0.2291＞0.05，沒有顯著差異，說明該模型與試驗結果擬合程度良好。該模型決定系數R2=0.9921，剔除二次項中不顯著項，將擬合方程修正為：Y=2.47+0.11A+0.15B+0.047C+0.070BC-0.16A2-0.22B2-0.17C2，調整后決定系數R2Adj為0.9871，大于0.80，進一步證明該模型與試驗結果擬合程度較好，變異系數CV=1.52%，說明預測值與試驗值相關性較好，試驗誤差較小，可用來對獅頭柑精油提取工藝進行分析和預測。

F值大小可以判斷各因素對試驗指標的重要程度，F值越大，說明此因素對獅頭柑精油得率的影響越大，通過表3 可以看出獅頭柑精油得率受3 種因素影響大小順序為：B＞A＞C，即超聲功率＞超聲溫度＞超聲時間。根據試驗結果可知，模型中A、B、A2、B2、C2對得率的影響極顯著（P＜0.001），C、BC 為高度顯著（P＜0.01），其余項對獅頭柑精油影響不顯著。

2.3.3 響應面試驗圖形分析 利用軟件Design-Expert V 10.0.1 模擬得到各因素交互作用對獅頭柑精油得率的三維響應面和等高線，通過三維響應面圖和等高線圖分析各因素之間交互作用的強弱。如圖9a 三維響應面圖，發現開口為向下的曲面圖，形如山丘一樣中間拱起，而四周相對較低的曲面，代表存在極大值，表明超聲功率與超聲時間兩因素交互作用對響應值的影響較強，兩者組合對獅頭柑精油得率影響較顯著。在等高線圖中，最小圓的中心響應值最大，圓形表示因素之間交互作用較弱，橢圓形表示因素之間交互作用較強，由圖9b 可以看出，超聲功率B 與超聲時間C 兩因素的交互作用對獅頭柑精油得率影響的等高線圖呈橢圓形，表明兩者組合對獅頭柑精油得率影響較強，這與2.3.1 中顯著性分析結果相一致。

圖9 各因素間交互作用對獅頭柑精油得率的響應面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour diagram of interaction between various factors on the extraction rate of essential oil of Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

2.3.4 最優工藝參數確定及驗證 通過Design-Expert V 10.0.1 軟件，并結合回歸模型和響應面圖分析得出獅頭柑精油得率的最佳工藝條件為：超聲溫度33.382 ℃、超聲功率83.752 W、超聲時間32.230 min，在該條件下模型預測獅頭柑精油得率為：2.517%±0.013%。為方便實際試驗操作，將最佳工藝條件修正為：超聲溫度33 ℃、超聲功率為80 W、超聲時間32 min，在此條件下重復驗證3次所得到的獅頭柑精油的得率為2.50%±0.02%，與預測值十分接近，說明此二次多項式回歸方程對獅頭柑精油得率的預測是可靠的，具有一定的實際指導意義。

2.4 水蒸氣蒸餾法提取獅頭柑精油的成分分析

利用GC-MS 方法分析獅頭柑精油成分，總離子色譜圖如圖10所示。所得質譜圖運用計算機Xcalibur 系統NIST2014 譜庫自動檢索，并結合文獻報道的已知化合物確認檢測物成分后，初步確認了29 種化學成分（表4）。

表4 獅頭柑精油GC-MS 分析結果Table 4 GC-MS analysis results of essential oil of Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

續表 4

圖10 獅頭柑精油成分總離子流Fig.10 Total ion flow of essential oil components of Citrus reticulata Blanco cv. Manau Gan

水蒸氣蒸餾法提取的獅頭柑精油中共鑒定出29 種相對含量較多的組分，共占氣相出峰總萃取物的99.16%。主要成分為烯烴類97.75%，主要有D-檸檬烯（88.35%），這與林夢雅[37]文中提到的柑橘皮中含有32%～98%的檸檬烯所吻合，其次是萜品烯（6.23%）、á-月桂烯（1.63%）、蒎烯（1.21%）這與王會全等[26]研究成果D-檸檬烯（84.22%）、萜品烯（6.55%）、月桂烯（1.67%）、α-蒎烯（1.13%）萜類化合物為柑橘皮精油的主要成分大體上吻合；除此之外還有少量的醇類0.27%，醛類0.26%等單萜類物質。特別地，2,2'-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）一般出現在玫瑰精油中[38-43]，這很可能是獅頭柑擁有不同于其他柑橘氣味的原因，有待進一步研究。

3 結論

對4 種水蒸氣蒸餾提取設備優選結果表明，Clevenger 揮發油蒸餾儀是獅頭柑精油的最佳水蒸氣提取設備；獅頭柑精油提取的最佳工藝為：粉碎時間25 s、料液比1:8 （g/mL）、超聲溫度33 ℃、超聲功率80 W、超聲時間32 min、蒸餾提取2.5 h，此條件下獅頭柑精油得率可達到2.50%±0.02%。通過氣相色譜-質譜法（GC-MS）對獅頭柑精油進行成分分析，主要包括烯烴類、醇類、醛類等，共鑒定出 29 種化合物，占總萃取物的99.16%，其中以D-檸檬烯相對含量最高，達到88.35%，萜品烯6.23%、á-月桂烯1.63%等。本研究對常用水蒸氣蒸餾提取設備進行提取效果比較，為水蒸氣蒸餾提取設備選擇方面提供理論參考；研究優化的精油提取工藝可用于獅頭柑精油提取生產，具有較好的提取效果，同時為其他柑橘類精油提取提供理論指導。