伊維菌素氧化降解雜質的分離與鑒定

馬志珺,王克華，任風芝 ,王 月，張 麗,李曉露*,張雪霞*

(1.微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業微生物代謝工程技術研究中心 華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，河北 石家莊 052165；2.華北制藥集團愛諾有限公司，河北 石家莊 052165)

伊維菌素作為一種新型抗寄生蟲藥物，具有廣譜、高效、低毒等特點，對線蟲、節肢動物及其它體內外寄生蟲的驅殺作用均良好，應用于豬、羊、馬、牛的胃腸道線蟲、肺線蟲的治療以及心絲蟲、疥螨等的防治[1-4]。

伊維菌素(H2B1a，圖1)為十六元環結構的大環內酯類抗生素，通過在阿維菌素B1a的C22、C23位上的雙鍵加氫還原而成，比阿維菌素結構更穩定、安全性更高、持效期更長[5-6]，在國內外市場上具有很強的競爭力。

圖1 伊維菌素的結構式

藥物雜質是反映藥物質量的重要指標，藥物雜質能否被合理、有效地控制，將直接影響藥物質量可控性及使用安全性。強制降解實驗屬于藥物穩定性研究內容之一，有助于揭示藥物的穩定性和可能降解途徑，對藥物的質量控制有重要意義。為了更好地控制伊維菌素質量，滿足高端客戶需求，作者將伊維菌素原粉在含有H2O2的甲醇溶液中進行加速降解，得到伊維菌素氧化降解雜質粗品，利用色譜純化技術對伊維菌素氧化降解雜質粗品進行分離純化，并運用MS、NMR分析對其結構進行鑒定，為伊維菌素的質量控制和安全性評價提供保障。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

伊維菌素(純度99.1%)，自制；乙腈、甲醇，色譜級，美國Merck公司；乙腈、甲醇，工業級，安徽時聯特種溶劑股份有限公司；純化水，自制；其它試劑均為國產分析純。

分析型液相色譜儀，日本島津公司；制備型液相色譜儀，北京創新通恒科技有限公司；T-1000型電子天平，常熟雙杰測試儀器廠；Acquity UPLC系統、Xevo TQ MS/MS檢測器，Waters公司；AVANCEⅢ-500型核磁共振波譜儀，Bruker公司；Loborata 4000型旋轉蒸發器，Heidolph公司。

1.2 伊維菌素的加速降解

取伊維菌素原粉10 g，用500 mL 80%甲醇溶液溶解，加入10 mL H2O2，搖勻后，于25 ℃下進行氧化降解反應，定期檢測反應液，當反應液中目標雜質達到一定比例時，將反應液減壓濃縮、干燥，得到伊維菌素氧化降解雜質粗品。

1.3 伊維菌素氧化降解雜質的分離純化

將伊維菌素氧化降解雜質粗品用甲醇溶解，經中壓柱(UniSil C18,20 μm,200 mL)進行層析分離，洗脫劑為甲醇-水(70∶30，體積比，下同)，流速為10 mL·min-1，根據洗脫峰分段收集洗脫液，HPLC在線檢測，檢測波長280 nm，收集目標雜質純度大于70%的洗脫液，減壓濃縮至干，得到高比例的氧化降解雜質粗品。

將高比例的氧化降解雜質粗品用制備型液相色譜儀經中高壓色譜純化技術進一步純化，按色譜峰收集目標餾分，將純度大于95%的餾分合并，50 ℃下減壓濃縮去除溶劑，得到2.1 g伊維菌素氧化降解雜質純品。

1.4 檢測條件

制備色譜條件：UniSil C18柱(30 mm × 250 mm，10 μm)，洗脫劑為乙腈-甲醇-水(50∶15∶35)，流速16 mL·min-1，檢測波長280 nm。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正、負離子檢測，離子源溫度為150 ℃，電離電壓為3.0 kV，電噴霧接口干燥氣(N2)流速為600 L·h-1，錐孔電壓為30 V，脫溶劑氣溫度為350 ℃。

核磁共振條件：樣品用CD3OD溶解。

2 結果與討論

2.1 加速降解條件選擇

在伊維菌素加速降解過程中發現，伊維菌素的氧化降解程度與H2O2加量、反應時間呈正相關，但過量的H2O2會使反應劇烈，生成多個降解產物，致使目標雜質分離純化難度加大。綜合考慮，選擇H2O2加量為2%，HPLC檢測目標雜質比例達到10%為反應終點。伊維菌素氧化降解雜質粗品和純品的HPLC圖譜見圖2。

圖2 伊維菌素氧化降解雜質粗品(a)和純品(b)的HPLC圖譜

2.2 伊維菌素氧化降解雜質的結構表征

2.2.1 質譜分析(圖3)

圖3 伊維菌素氧化降解雜質的質譜圖

2.2.2 核磁共振波譜分析

伊維菌素氧化降解雜質的13CNMR、1HNMR數據見表1。

表1 伊維菌素氧化降解雜質的13CNMR、1HNMR數據

2.2.3 結構解析

由ESI+準分子離子峰圖譜得到m/z906[M+NH4]+；由ESI-準分子離子峰圖譜得到m/z887[M-H]-。推測伊維菌素氧化降解雜質的相對分子質量為888，比伊維菌素的相對分子質量多14。參照文獻[7-8]對NMR數據進行分析，發現該雜質C8a位由亞甲基變成了羰基，推測其分子式為C48H72O15。

綜上，確定該氧化降解雜質為8a-oxo-H2B1a，其結構式見圖4。

圖4 伊維菌素氧化降解雜質的結構式

3 結論

伊維菌素原粉在含有H2O2的甲醇溶液中進行加速降解，得到伊維菌素氧化降解雜質粗品，利用色譜純化技術對伊維菌素氧化降解雜質粗品進行分離純化，并運用MS、NMR分析鑒定其結構，確定該氧化降解雜質為8a-oxo-H2B1a。該研究開發了一種制備伊維菌素氧化降解雜質的有效方法，揭示了雜質的來源、結構及控制方法，為伊維菌素的質量控制和安全性評價奠定了基礎。