油污降解菌劑YW-I的制備及降解油污實驗

司曉光，張曉青，成 玉，曹軍瑞

(自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

石油在開采、冶煉、運輸和使用過程中，經常會伴隨著石油泄漏導致的環境污染[1-3]。同其它污染物相比，油污與土壤之間具有更強的親和力，因此，油污土壤的治理難度更大，成本更高[4-6]。

目前，油污土壤的治理方法主要有物理法、化學法和生物法，其中物理法、化學法的治理成本較高，操作復雜，技術要求較高，同時治理不合理會產生二次污染。而生物法中的微生物修復則具有成本低、效率高、無二次污染等優點，成為世界各國學者研究的熱點之一[7-10]。微生物修復是指利用微生物的代謝機理，通過人為添加土著微生物或者外源微生物，并為其提供適宜的生存環境，從而提高其代謝速率，以達到去除油污的目的[11-14]。

作者將實驗室篩選的油脂降解菌YZ-042發酵液與生物表面活性劑產生菌BM-029發酵液進行復配，制備油污降解菌劑YW-I(簡稱YW-I菌劑)，擬為油污土壤的治理提供可靠的技術產品。

1 實驗

1.1 材料

原油樣品：采自天津大港油田，常溫下為黑色黏稠物，密度為0.862 g·mL-1，室溫下黏度為12.35 mm2·s-1。

污染土壤：采自天津大港油田原油污染區域，土壤樣品呈棕色至褐色。

菌株YZ-042：本實驗室保存的一株用于降解油脂的菌株，篩選自油田附近的土壤樣品。

菌株BM-029：本實驗室保存的一株產生物表面活性劑的菌株，篩選自海河入海口附近的淤泥。

種子培養基：牛肉膏 3 g、蛋白胨 5 g、NaCl 5 g、蔗糖 9 g，定容至1 L，滅菌。

發酵培養基：氯化銨0.5 g、硫酸鎂0.15 g、三氯化鐵0.1 g、磷酸氫二鉀0.3 g、磷酸二氫鈉0.5 g、氯化鈣0.1 g、玉米淀粉糖化液2 g、玉米漿5 g，定容至1 L，滅菌。

油污降解培養基：氯化銨0.5 g、硫酸鎂0.15 g、三氯化鐵0.1 g、磷酸氫二鉀0.3 g、磷酸二氫鈉0.5 g、氯化鈣0.1 g、玉米淀粉糖化液0.5 g、玉米漿3 g、原油5 g，定容至1 L，滅菌。

1.2 YW-I菌劑的制備

將菌株YZ-042、BM-029分別用平板劃線法接種于種子培養基中，30 ℃培養箱中培養48 h，挑取單菌落接種于發酵培養基中，30 ℃搖床培養48 h，獲得菌株YZ-042、BM-029的發酵液。將兩種發酵液分別按復配比例(VYZ-042發酵液∶VBM-029發酵液)1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1制備液體YW-I菌劑，經離心、洗滌、干燥后，獲得YW-I菌劑。

1.3 YW-I菌劑的保存條件研究

將YW-I菌劑分別保存在低溫(4 ℃冰箱)、室溫(約25 ℃)和高溫(40 ℃)下，分別于0 d、30 d、60 d和90 d取樣，采用稀釋涂布法測定YW-I菌劑中的有效活菌數，考察保存溫度和保存時間對YW-I菌劑的影響。

1.4 YW-I菌劑降解油污實驗

取2 g YW-I菌劑接種到油污降解培養基中，30 ℃搖床培養，每隔24 h取樣，測定油污去除率。以滅活的YW-I菌劑作為對照。

1.5 油污土壤修復實驗

稱取干化的污染土壤10 g，加入到未受石油污染的土壤中，獲得油污土壤；另取10 g YW-I菌劑溶于10 mL發酵培養基中，稀釋至100 mL，獲得YW-I土壤修復液。按照油污土壤質量的2%噴灑YW-I土壤修復液，每隔2 d噴灑清水保持土壤濕潤，分別于0 d、10 d、20 d、30 d取樣，測定土壤中油污含量。以滅活的YW-I菌劑作為對照。

1.6 分析方法

1.6.1 有效活菌數的測定

稱取1 g YW-I菌劑加入到250 mL無菌錐形瓶中，加入10顆玻璃珠、50 mL無菌水，充分搖勻，稀釋至不同梯度；取100 μL稀釋液涂布到平板上，30 ℃下培養48 h，計算有效活菌數。

1.6.2 發酵液中油污去除率的測定

將100 mL YW-I菌劑降解油污實驗發酵液轉移到分液漏斗中，加入50 mL石油醚，充分混勻、振蕩，靜置分層，取上層有機相，加入無水硫酸鈉脫水；吸取0.5 mL脫水后的有機相至50 mL容量瓶中，用石油醚定容；測定235 nm處的吸光度(A)。測定對照組235 nm處的吸光度(A0)。油污去除率按式(1)計算：

(1)

1.6.3 土壤中油污含量的測定

取2 g油污土壤樣品，置于干燥器中干燥后粉碎，用質量為M1的干凈濾紙包好，以石油醚為萃取劑，索氏抽提萃取5 h；取出濾紙包在烘箱中恒溫烘干，然后置于干燥器中冷卻至室溫，稱重為M2；用重量法測定索氏抽提萃取液中的油污質量M3，土壤中油污含量按式(2)計算：

(2)

2 結果與討論

2.1 YW-I菌劑的復配比例優化(圖1)

圖1 復配比例對油污去除率的影響

由圖1可以看出，菌株YZ-042發酵液和菌株BM-029發酵液的復配比例對油污去除率有一定的影響，在復配比例為2∶1時，油污去除率最高。油污的微生物降解是一個復雜的微生物反應過程，是菌群協同作用的結果，需有專門的以油脂作為自身生長繁殖要素的微生物，同時還應有增加油污與水相互溶的微生物或其相關活性產物。YW-I菌劑中既有油脂降解菌，又有生物表面活性劑產生菌，大大提高了油污的降解效率。選擇YW-I菌劑的最佳復配比例為2∶1。

2.2 YW-I菌劑的保存條件研究(圖2)

圖2 保存條件對YW-I菌劑的影響

由圖2a可以看出，隨著保存時間的延長，40 ℃下保存的YW-I菌劑的有效活菌數不斷減少，90 d后YW-I菌劑的有效活菌數的數量級由最初的1011降至105；而4 ℃和25 ℃下保存90 d后，YW-I菌劑的有效活菌數的數量級分別為1010和109。可見，YW-I菌劑中的活菌對溫度較為敏感，低溫和室溫條件下保存90 d后有效活菌數的數量級仍在109以上，滿足使用要求。溫度影響微生物的生長代謝，通常溫度越低，微生物的生長代謝越緩慢，越有利于微生物的保存；但是低溫保存會增加保存成本。綜合考慮，YW-I菌劑常溫保存。

由圖2b可以看出，隨著保存溫度的升高和保存時間的延長，油污去除率總體呈下降趨勢，與圖2a中有效活菌數的變化趨勢一致。表明，YW-I菌劑降解油污效果與YW-I菌劑的有效活菌數有關。

2.3 YW-I菌劑降解油污效果(圖3)

由圖3可以看出，0～3 d內，隨著降解時間的延長，實驗組和對照組的油污去除率均逐漸升高，而3 d后對照組的油污去除率基本維持不變，約為11.54%；而實驗組的油污去除率則繼續升高，7 d時達到最高，為33.24%。表明添加YW-I菌劑后，能顯著去除發酵液中的油污。通常單一菌種對油污的降解能力有限，而將不同菌種復配構成復合菌劑，則能讓微生物發揮協同作用，共同完成油污的降解過程。

圖3 YW-I菌劑對油污的降解效果

2.4 油污土壤修復效果(圖4)

圖4 YW-I菌劑修復油污土壤的效果

由圖4可以看出，土壤中最初的油污含量為2.5%，經過30 d的降解后，實驗組土壤中的油污含量降為1.23%，油污去除率達到50.8%，而對照組的油污含量為2.4%,油污去除率僅為4%。實驗發現，YW-I菌劑修復油污土壤與搖瓶中的油污降解實驗不同，在油污土壤中，YW-I菌劑的作用時間更長(需要30 d的降解周期)，降解效率更高(油污去除率50.8%)；而在搖瓶中降解7 d即達到最高油污去除率33.24%(圖3)。YW-I菌劑應用于油污土壤的修復，是多相、非均質的復雜過程，涉及微生態、環境化學、土壤學等學科，還需要更深入的研究YW-I菌劑修復油污土壤的工藝條件，以提高對油污的降解效率。

3 結論

將油脂降解菌YZ-042發酵液與生物表面活性劑產生菌BM-029發酵液按最佳復配比例2∶1制備油污降解菌劑YW-I。在4 ℃下保存30 d后的YW-I菌劑的有效活菌數的數量級仍保持在初始數量級1011，在25 ℃下保存30 d后的YW-I菌劑的有效活菌數的數量級為1010，在4 ℃和25 ℃下保存90 d后的YW-I菌劑的有效活菌數的數量級分別為1010和109，綜合分析保存經濟成本，YW-I菌劑可以常溫保存。YW-I菌劑在油污發酵液中的降解周期約為7 d，油污去除率最高為33.24%。YW-I菌劑用于油污土壤修復30 d后，土壤中的油污去除率達到50.8%，油污降解效果明顯。