乙酰化玉竹多糖的合成工藝優(yōu)化

呂 偉，陳子龍，劉思美，尹秀麗，張麗華，趙 鵬

(1.陜西省藥品和疫苗檢查中心，陜西 西安 710065；2.渭南市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 渭南 714000；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

玉竹為百合科植物玉竹(Polygonatumodoratums(Mill.)Druce)的干燥根莖，也被稱(chēng)為玉參、鈴鐺菜、甜草根等[1]，廣泛分布于我國(guó)西南地區(qū)，是一種歷史悠久的藥食兩用藥材[2-4]。多糖是玉竹的主要活性成分之一，具有降血糖、抑菌、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)糖脂代謝等多種生理活性[5-6]。對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾可賦予其一些新的理化性質(zhì)，提高其生物活性，是目前多糖研究的熱點(diǎn)之一[7]。其中乙酰化是最常見(jiàn)的多糖修飾方法，多糖經(jīng)乙酰化修飾后，其抗氧化和抗腫瘤活性均得到一定程度的提高[8-9]。

目前，對(duì)于玉竹多糖的研究多集中在分離純化、結(jié)構(gòu)分析和活性評(píng)價(jià)等方面，而通過(guò)乙酰化來(lái)提高玉竹多糖活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。基于此，作者通過(guò)乙酸酐法合成乙酰化玉竹多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化乙酰化玉竹多糖的合成工藝，以期為玉竹多糖的深入開(kāi)發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

玉竹飲片，購(gòu)于陜西省西安市萬(wàn)壽路中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)趙鵬教授鑒定為百合科植物玉竹(Polygonatumodoratums(Mill.)Druce)的干燥根莖。

β-D-五乙酰葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、透析袋(MW=3500)，上海源葉生物科技有限公司；乙酸酐、濃硫酸、苯酚、氫氧化鈉等試劑均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；FA2004型電子天平，上海民橋精科天平廠；TDZ5-WS型臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；4.5 L型真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 乙酰化玉竹多糖的合成

1.2.1 玉竹多糖的提取

稱(chēng)取干燥后的玉竹飲片300 g，粉碎過(guò)60目篩，加入12倍質(zhì)量的水，加熱至微沸并保持1.5 h，過(guò)濾，得濾液；藥渣加入10倍質(zhì)量的水再提取1.5 h，過(guò)濾；合并濾液，濃縮至原體積的10%，濃縮液冷卻至室溫，加入4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉；醇沉結(jié)束后靜置24 h，抽濾，將濾餅于80 ℃下烘干，即得玉竹粗多糖。將粗多糖配成飽和溶液，利用Sevage法脫蛋白，再用雙氧水法脫色；脫色后的玉竹多糖裝入透析袋中，流水透析48 h，去離子水再透析24 h，透析液濃縮，凍干，即得玉竹多糖。

1.2.2 玉竹多糖的乙酰化

根據(jù)文獻(xiàn)[10-12]的乙酰化方法，略加調(diào)整。稱(chēng)取3.0 g玉竹多糖，用去離子水配成飽和溶液，加入20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為9.0，升溫至一定溫度，緩慢滴加一定量的乙酸酐；滴加結(jié)束后恒溫反應(yīng)，直至乙酰化反應(yīng)完全；取出反應(yīng)液，加入2.0 mol·L-1稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，將反應(yīng)液置于透析袋中，流水透析3 d，取出透析液，真空下濃縮成膏狀物，凍干，即得乙酰化玉竹多糖。

1.3 玉竹多糖乙酰化取代度的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]方法繪制β-D-五乙酰葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程：A=16.714c+0.0795，R2=0.9915。β-D-五乙酰葡萄糖濃度在0.01～0.09 mg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，與吸光度線性關(guān)系較好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品中乙酰基含量。按下式計(jì)算玉竹多糖乙酰化取代度：

1.4 乙酰化玉竹多糖的合成工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察反應(yīng)時(shí)間(2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h)、物料比[m(乙酸酐)∶m(玉竹多糖)，1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1]、反應(yīng)溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度的影響。

1.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以玉竹多糖乙酰化取代度為響應(yīng)值，以反應(yīng)時(shí)間、物料比、反應(yīng)溫度為響應(yīng)變量，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間的影響

在反應(yīng)溫度為50 ℃、物料比為1.5∶1的條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度的影響

從圖1可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，玉竹多糖乙酰化取代度逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3.5 h時(shí)，取代度達(dá)到最大；繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，取代度呈略微下降趨勢(shì)，可能是由于，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使部分乙酰化玉竹多糖發(fā)生了分解，從而降低了取代度。因此，以3.5 h為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間的中心點(diǎn)。

2.1.2 物料比的影響

在反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間為3.5 h的條件下，考察物料比對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 物料比對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度的影響

從圖2可知，隨著物料比的增大，玉竹多糖乙酰化取代度逐漸增大，這是由于，隨著乙酸酐用量的增加，玉竹多糖與乙酰化試劑碰撞的幾率增大，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行；當(dāng)物料比為2.5∶1時(shí)，取代度達(dá)到最大；繼續(xù)增大物料比，此時(shí)乙酸酐的水解速度超過(guò)了乙酰化反應(yīng)速度，反應(yīng)液的pH值下降，導(dǎo)致取代度下降。因此，確定2.5∶1為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)物料比的中心點(diǎn)。

2.1.3 反應(yīng)溫度的影響

在物料比為2.5∶1、反應(yīng)時(shí)間為3.5 h的條件下，考察反應(yīng)溫度對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，玉竹多糖乙酰化取代度呈迅速增大的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，取代度達(dá)到最大；繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，取代度逐漸下降。這可能是由于，反應(yīng)溫度的升高，有助于增強(qiáng)底物的反應(yīng)活性，使得取代度增大；當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)60 ℃后，過(guò)高的反應(yīng)溫度可能使乙酸酐的水解速度超過(guò)了乙酰化反應(yīng)速度，反應(yīng)液的pH值下降，并造成部分乙酰化玉竹多糖發(fā)生了分解，導(dǎo)致取代度下降。因此，確定60 ℃為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度的中心點(diǎn)。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

表3 方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度影響的響應(yīng)面圖如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度影響的響應(yīng)面圖

響應(yīng)面及所對(duì)應(yīng)的等高線可反映單因素交互作用影響的顯著性，響應(yīng)面趨于圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用影響不顯著；反之，響應(yīng)面趨于橢圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用影響顯著[15-17]。由圖4可知，3個(gè)因素之間的交互作用影響均較大。其中，反應(yīng)溫度的曲線最為密集陡峭，其對(duì)玉竹多糖乙酰化取代度的影響最大。

對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)并使之等于0[18]，X1=-0.12，X2=0.431，X3=-0.258，由此可得預(yù)測(cè)的乙酰化玉竹多糖的最佳合成工藝如下：反應(yīng)時(shí)間為3.44 h、物料比2.7155∶1、反應(yīng)溫度為57.42 ℃，取代度預(yù)測(cè)值為0.358。綜合考慮預(yù)測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)際操作可行性，將乙酰化玉竹多糖的最佳合成工藝調(diào)整為：反應(yīng)時(shí)間3.44 h、物料比為2.7155∶1、反應(yīng)溫度60 ℃，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，取代度平均值為0.351。表明通過(guò)響應(yīng)面法預(yù)測(cè)的玉竹多糖乙酰化取代度與實(shí)際值基本吻合。

3 結(jié)論

通過(guò)乙酸酐法合成乙酰化玉竹多糖，確定最佳合成工藝如下：反應(yīng)時(shí)間為3.44 h、物料比m(乙酸酐)∶m(玉竹多糖)為2.7155∶1、反應(yīng)溫度為60 ℃，在此條件下，玉竹多糖乙酰化取代度為0.351。該工藝路線可行，具有反應(yīng)條件溫和、試劑廉價(jià)易得、多糖乙酰化取代度較高、易于放大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是一種較理想的多糖乙酰化修飾方法。