基于網絡藥理學方法探討芪歸通絡口服液治療短暫性腦缺血發作的作用機制

黃 金，高 敏

(1.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣州 510000； 2.廣東省第二中醫院腦病科，廣州510000)

短暫性腦缺血發作(transient ischemic attack，TIA)是腦、脊髓或視網膜局灶性缺血所致、未發生急性腦梗死的短暫性神經功能障礙[1]。中國國家卒中登記研究分別于2007年[2]、2012年[3]和2015年[4]基于醫院的登記顯示，TIA患者占所有以急性腦血管病入院患者的6.20%、8.00%和6.70%。TIA的發病意味著更高的潛在腦卒中風險，研究結果顯示，TIA后2 d、7 d、30 d和90 d腦卒中發生概率分別為3.5%、5.2%、8.0%和9.2%[5-6]。積極的早期干預，對防治TIA進展為缺血性腦卒中至關重要，目前對于TIA治療及二級預防的主流意見均以阿司匹林、氯吡格雷為首選[7-8]。上述兩藥均有不可忽視的消化系統不良反應，阿司匹林在直接刺激胃黏膜的同時抑制環氧合酶-1，減少前列腺素E2的黏膜保護作用，引起消化道潰瘍甚至出血[9]；氯吡格雷抑制內皮生長因子，加重已存在的胃腸道黏膜損傷[10]。

清代醫家王清任認為“元氣不足”是中風病發生的根本原因，立益氣活血法，創補陽還五湯[11]。芪歸通絡口服液為廣東省第二中醫院專科特色制劑(批準文號：粵藥制字Z20090014)，根據補陽還五湯加減化裁，主要由黃芪、當歸、三七、赤芍、丹參、地龍、牛膝和雞血藤8味藥物組成，有補氣通絡、活血化瘀和強筋骨之效，在臨床被廣泛用于各類缺血性腦血管的氣虛血瘀證，療效可靠，不良反應少。但其具體機制尚未深入闡明。本研究應用網絡藥理學方法，試探索芪歸通絡口服液治療TIA的可能作用機制，并進行分子模擬對接的初步驗證。

1 資料與方法

1.1 化學成分庫的構建

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)[12]、中醫藥百科全書數據庫(ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/)[13]并結合文獻檢索，收集黃芪、當歸、三七、赤芍、丹參、地龍、牛膝和雞血藤的主要化學成分。

1.2 活性化合物的篩選

中醫湯劑以口服為主，選取口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)對化合物的吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)和排泄(Excretion)性質進行預測，評價其潛在活性[14]。將來自TCMSP數據庫的化學成分以OB≥30%、DL≥0.18作為篩選條件[15]；將來自ETCM數據庫的化學成分以Druglikeness Grading評分為“Moderate”或“Good”，Druglikeness Weight≥0.5作為篩選標準。

1.3 藥物與疾病的靶點收集

通過檢索TCMSP、ETCM、DrugBank和PubChem數據庫，PubMed、中國知網和萬方數據庫進行文獻挖掘收集，獲取藥物的潛在靶點。通過GeneCards、人類孟德爾遺傳綜合數據庫獲取TIA的疾病靶標。

1.4 活性成分-作用靶點網絡構建和分析

利用Cytoscape 3.7.0軟件[16]構建中藥復方-單味藥-活性成分-作用靶點-疾病靶標網絡模型，利用Network Analyzer功能獲得的度值和中介度等參數對模型進行分析。使用Cytoscape中的Generate style from statistics工具將節點大小、邊的粗細與度值、Combine score大小相適應。

1.5 靶點相互作用網絡

STRING數據庫(https://string-db.org/, Version 11.0)[17]基于多種數據來源和證據，收錄豐富的蛋白質及其相互作用信息。將獲取的藥物-疾病共同靶點導入STRING數據庫，得到蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)信息，導出為TSV格式，輸入Cytoscape軟件繪制PPI網絡，并進行分析。

1.6 靶點的分子功能/生物過程和通路富集分析

使用WebGestalt在線工具(http://www.webgestalt.org/)[18]進行基因本體(GO)功能富集分析。選擇物種為“homo sapiens”，采用Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)富集分析算法，分別對生物學過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組成(CC)進行GO富集分析，并繪制柱狀圖。將篩選得到的交集靶點輸入DAVID 6.8數據庫中進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.7 分子對接

選取活性成分-作用靶點網絡中度值較大的活性成分與蛋白靶點進行初步的分子對接驗證。從TCMSP數據庫下載小分子的mol文件，于PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)獲取蛋白的PDB文件。使用Autodock 4.2.6軟件[19]進行蛋白-分子對接，利用Pymol 2.2軟件對蛋白進行除氫、去水和去除小分子配體等預處理以及對接結果的可視化展示。

2 結果

2.1 芪歸通絡口服液中的活性成分及對應的潛在靶點信息

經TCMSP數據庫、ETCM數據庫以及相關文獻檢索查找，去除重復項，共獲取芪歸通絡口服液全方符合條件的化學成分：黃芪49種，當歸48種，赤芍32種，牛膝23種，丹參114種，雞血藤41種，三七32種，地龍8種，共347種化學成分。進一步得到潛在靶點403個，疾病靶標218個。繪制韋恩圖，見圖1。芪歸通絡口服液、TIA交集得到40個重合靶點，即藥物-疾病共同靶點。

圖1 藥物與疾病靶點基因交集韋恩圖

2.2 活性成分-作用靶點網絡構建和分析

利用Cytoscape 3.7.0軟件構建中藥復方-單味藥-活性成分-作用靶點-疾病靶標網絡，共137個節點，357條邊，見圖2。六邊形節點表示芪歸通絡口服液整體復方，八邊形節點表示疾病TIA，正方形節點表示各中藥組成，平行四邊形節點表示中藥所含化學成分，圓形節點表示藥物-疾病共同靶點，并依次相互連接。節點度值表示節點在網絡中的連接度[20]。本網絡中，度值較高的節點，中藥有丹參(30)、黃芪(17)和當歸(14)；化合物有槲皮素(quercetin)(33)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)(14)、木犀草素(luteolin)(12)和大豆苷元(daidzein)(10)；靶點有雌激素受體1(ESR1)(56)、胱天蛋白酶3(CASP3)(22)、凝血因子7(F7)(10)、血管內皮生長因子A(VEGFA)(10)和白細胞介素6(IL-6)(10)。

2.3 藥物-靶點-疾病相互作用網絡構建與分析

通過Cytoscape軟件繪制PPI網絡，見圖3。圖中共包含40個節點，245個邊，節點平均度值為12.2，平均局部聚類系數為0.637，PPI富集均值<1.0×10-16。

圖2 芪歸通絡口服液單味藥-活性成分-作用靶點-疾病相互作用網絡

2.4 預測作用靶點的GO功能富集分析

經WebGestalt分析平臺對潛在作用靶點進行GO功能富集分析，繪制柱狀圖，見圖4。其中，BP相關主要涉及刺激反應、生物調節、定位和細胞信號傳導等；MF相關主要涉及蛋白質結合、離子結合、水解酶活性、分子轉導活性和酶調節活性等；CC相關主要涉及細胞膜、囊泡、蛋白質復合體、內膜系統、膜封閉腔和細胞外間隙等。結果提示，芪歸通絡口服液治療TIA相關的關鍵靶標可能與細胞信號轉導、細胞膜和調節酶的活性等BP有一定關系。

A.BP；B.CC；C.MFA.BP；B.CC；C.MF

2.5 KEGG通路富集分析結果

通過KEGG通路富集分析，獲取芪歸通絡口服液治療TIA相關的通路，得到P<0.05的信號通路77條，以Count值降序篩選處排序居前20位的KEGG通路輸出柱形圖和氣泡圖。結果提示，關鍵基因靶點主要涉及糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications)、缺氧誘導因子-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、血小板激活(platelet activation)和流體剪切力與動脈粥樣硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)等，見圖5。

圖3 芪歸通絡口服液靶點相互作用網絡

2.6 分子對接結果

圖2中節點度值較高的活性成分有槲皮素、木犀草素和大豆苷元，核心靶點蛋白包括CASP3、VEGFA和IL-6，分別進行分子對接驗證，結果見表1。并進行分子對接模式圖展示，見圖6。結果顯示，各活性成分與蛋白對接的結合自由能均<-20.93 kJ/mol，有較高的親和力[21]。

A.IL-6與大豆苷元對接圖；B.VEGFA與大豆苷元對接圖；C.CASP3與大豆苷元對接圖；D.IL-6與木犀草素對接圖；E.VEGFA與木犀草素對接圖；F.CASP3與木犀草素對接圖；G.IL-6與槲皮素對接圖；H.VEGFA與槲皮素對接圖；I.CASP3與槲皮素對接圖A. docking diagram of IL-6 and daidzein; B. docking diagram of VEGEFA and daidzein; C. docking diagram of CASP3 and daidzein; D. docking diagram of IL-6 and luteolin; E. docking diagram of VEGFA and luteolin; F. docking diagram of CASP3 and luteolin; G. docking diagram of IL-6 and quercetin; H. docking diagram of VEGEFA and quercetin; I. docking diagram of CASP3 and quercetin

表1 主要活性成分與疾病靶點的分子對接結果

3 討論

本研究進行了“中藥-活性成分-靶點”關系網絡的構建及多層次功能分析，結果提示，芪歸通絡口服液中蚓激酶(earthworm fibrinolytic enzyme)、槲皮素、木犀草素、大豆苷元、丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)和丹酚酸A(salvianolic acid A)等為芪歸通絡口服液全方的主要活性成分；ESR1、CASP3、F7、VEGFA、纖溶酶原(PLG)和P2Y嘌呤受體12等靶標作用于HIF-1、Platelet activation、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)等信號通路是干預TIA的關鍵路徑。

圖5 芪歸通絡口服液治療TIA潛在核心靶點的KEGG通路富集分析

文獻統計結果顯示，中風病氣虛血瘀證的用藥中，地龍的使用頻次高居第3位，與當歸并列，可見其獨特作用[22]。地龍藥用歷史悠久，《神農本草經》[23]中已有記載，《滇南本草》[24]謂其“味苦、辛，性寒。祛風。治……口眼歪斜”。清代醫家葉天士指出，蟲類藥“飛者升，走者降，靈動迅速，追拔沉混氣血之邪”[25]，非普通草木、礦石之藥所能及。藥理學研究結果顯示，地龍富含脂類[26]、蛋白質[27]、酶類、氨基酸[28]、微量元素[29]和核苷酸[30]等成分，其中蚓激酶在治療腦血管病中起到核心作用。蚓激酶具有纖溶酶活性，有組織纖溶酶原激活物和抗纖溶酶原激活物抑制劑樣作用，能通過激活纖溶酶原，產生降解纖維蛋白和纖維蛋白原的纖溶酶[31]；另一方面，能增加組織間其他纖維蛋白溶酶原激活物的活性，抑制凝血途徑[32]。《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》[33]推薦，血漿纖維蛋白原和血液黏滯度升高的缺血性腦血管病患者使用蚓激酶進行降纖治療。本研究的藥物-靶點相互作用網絡顯示，蚓激酶作用于PLG靶點，在一定程度上闡釋了蟲類藥“通經達絡，搜剔疏利”獨特功效的藥理學內在機制。槲皮素為三七、黃芪和牛膝的共有成分，作用于CASP3、F7、VEGFA、IL-6、ALOX5和NOS3等多個靶點。槲皮素通過下調CD80、CD86、MHC-Ⅱ、IL-6和IL-12的表達，降低刺激T細胞異基因增殖的能力，并上調Dabs蛋白表達，抑制樹突細胞成熟，從而下調SRC/PI3K/Akt/核因子κB炎癥途徑來抑制炎癥反應和AS的形成[34]。

ESR1是本網絡構建中最高節點度值的靶點，大量活性成分作用與該靶點相互作用。ESR1作為經典核受體，與神經系統和內分泌系統活動相關，調控靶基因的轉錄而發揮“基因型”調節效應[35]。研究結果表明，雌激素通過拮抗興奮性氨基酸毒性[36]、抗氧化應激[37]、增加腦部血流量[38]、抑制凋亡通路[39-40]和抑制動脈粥樣硬化[41]等多個過程參與調節缺血性腦卒中的發生。芪歸通絡口服液全方共52種成分作用于ESR1靶點，其中大豆苷元[42]、丹參酮ⅡA[43]等代表性雌激素成分，起到防治腦血管病的重要作用。

KEGG通路富集結果顯示，在HIF-1、Platelet activation等信號通路上有較高的富集程度。缺氧是神經細胞低灌注下的損傷機制之一。HIF在缺氧應激條件下充當許多缺氧誘導基因的主要調節因子，通過快速調節氧依賴性信號傳導級聯和下游基因的活化，調節細胞內能量利用水平，以改善缺血性疾病中代謝的變化[44]。缺氧條件下，經上游的mTOR、絲裂原激活的蛋白激酶和PI3K-Akt多個信號通路作用，激活HIF-1α轉錄因子，調節下游的VEGF信號通路，阻斷細胞凋亡[45]，并對神經有直接保護作用[46]；同時激活iNOS、eNOS，使血管平滑肌松弛，降低血壓，并改善局部腦組織再灌注[47]。抗血小板治療是目前防治TIA的一線選擇，本研究結果顯示，芪歸通絡口服液全方在Platelet activation信號通路上富集的有P2Y12、PI3K、Akt、F2和eNOS等靶點。PI3K/AKT通路是誘導血小板顆粒釋放、激活及黏附的上游信號放大途徑之一。PI3K家族中，PI3Kβ、PI3Ky在血小板信號轉導中起著關鍵作用[48]；PI3K的激活可致血小板內Akt的主要亞型Akt-1和Akt-2磷酸化，進一步激活下游eNOS等靶點，介導血小板激活過程[49]。丹參中有效成分丹酚酸A，即通過該信號通路有效抑制下游分子Akt的磷酸化，降低血小板激活[50]。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法探討了芪歸通絡口服液對TIA的潛在作用機制，采用分子模擬對接進行了初步驗證，為芪歸通絡口服液多成分、多靶點、多通路綜合防治TIA的可能作用機制提供了參考，為后續更深入、切實的實驗驗證研究提供了一定的理論方向。