槲皮苷對小鼠變應性鼻炎的治療作用研究Δ

董金葉，孫 月，秦 紅，朱 琳，鞠 葉#

(1.青島大學附屬婦女兒童醫院耳鼻喉科，山東 青島 266000； 2.中國人民解放軍海軍第九七一醫院耳鼻咽喉科，山東 青島 266071)

變應性鼻炎(anaphylactic rhinitis，AR)為全世界常見的鼻腔疾病，指發生在鼻黏膜的由免疫球蛋白E(IgE)介導的變態反應性疾病，以鼻癢、打噴嚏及鼻黏膜腫脹為主要表現，為臨床常見病和多發病[1]。流行病學調查結果顯示，隨著生活環境破壞、污染加重等，AR的發病率呈逐年升高趨勢[2]。AR會嚴重影響患者的生活質量，導致情緒障礙及經濟負擔等，但目前關于AR的治療只能緩解其癥狀，因此，積極探索更有效的治療方案和藥物是首要任務。槲皮苷屬于天然黃酮苷化合物，目前研究結果顯示其具有廣泛的治療效果，不僅在抗心腦血管疾病[3]、免疫調節[4]、神經保護[5]及調節血脂[6]等方面具有良好的藥理活性，而且具有抗過敏[7]、抗氧化[8]和抗腫瘤[9]等重要作用。但目前尚無明確研究顯示槲皮苷在AR中的確切效果。本研究通過AR模型小鼠，探討槲皮苷對AR的治療效果及相關作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

6周齡Balb/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證編號為SCXK(京)2017-0015，小鼠體質量為26～32 g，均為雌性，飼養于SPF級動物房中適應1周，自由攝食進水，相關操作均符合動物醫學倫理相關規定。

1.2 儀器

Centrifuge 5420型離心機(德國Eppendorf公司)；DM2700M型顯微鏡(美國Leica公司)；LSM-900型激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.3 藥品與試劑

槲皮苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為5280459)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號為H052-1)；Diff-Quik染色試劑盒(西安齊岳生物科技有限公司，批號為148983)；1∶ 400 抗嗅覺標記蛋白(OMP)抗體(上海拜力生物科技有限公司，批號為548985)；4%卵蛋白溶液(北京博奧森生物技術有限公司，批號為AH06C17756)；Al(OH)3(美國Sigma公司，批號為V900163)；乙二胺四乙酸溶液(美國Sigma公司，批號為464534)；PBS緩沖液(美國賽默飛公司，批號為627813)；山羊血清(美國賽默飛公司，批號為c545489)；0.03% Triton X-100封閉液(美國賽默飛公司，批號為5487558)；FITC結合的山羊抗兔二級抗體(美國賽默飛公司，批號為4724869)HE染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，批號為164135a)；PAS染色試劑盒(美國Sigma公司，批號為1649881)。

2 方法

2.1 卵蛋白誘導的AR小鼠模型和槲皮苷治療

6周齡雌性Balb/c小鼠在無特定病原體環境中隨意獲得無菌食物和水。所有動物均按照實驗動物護理和使用委員會批準的方案處理。將小鼠隨機分為三組(n=10)，即對照組、模型組(卵蛋白)和治療組(卵蛋白+槲皮苷)。AR小鼠模型建立(模型組)：采用目前國內常用的“卵蛋白注射及其鼻黏膜刺激法”，卵蛋白0.3 mg、Al(OH)330 mg 及0.9%氯化鈉溶液1 mL混合后于小鼠腹腔注射初次免疫，第2—14日小鼠正常飼養，第15—21日每側鼻孔給予4%卵蛋白溶液(20 μL/只)刺激小鼠鼻孔。對照組：腹腔注射Al(OH)3，然后在第15—21日用0.9%氯化鈉溶液刺激小鼠鼻孔。治療組：在模型組基礎上，第15—21日每側鼻孔給予4%卵蛋白溶液(20 μL/只) 刺激小鼠鼻孔，同時在第15—21日每日加用槲皮苷(純度≥98%)50 mg/kg灌胃。

2.2 過敏癥狀評估和鼻腔灌洗液樣品制備

在第21日最后一次卵蛋白鼻腔刺激后20 min內，對所有小鼠的早期反應(包括鼻摩擦次數和噴嚏次數)進行計數，并以盲法記錄，共10 min。在最后一次鼻腔刺激2 h后，采集小鼠血液和鼻腔灌洗液樣本，以1 600 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)。將血漿和鼻腔灌洗液上清液儲存于-80 ℃以進行后續實驗。此外，將小鼠顱骨矢狀打開，獲取鼻中隔及其黏膜，并儲存于-80 ℃以進行后續實驗。

2.3 組織病理學檢查

鼻中隔的標本在10%甲醛中固定24 h；用去離子水清洗后浸泡在乙二胺四乙酸溶液中脫鈣3～4周；然后石蠟包埋；組織切片(厚度為3 μm)用蘇木精-伊紅(HE)染色(用于組織病理學變化的定性評價)、高碘酸-希夫(PAS)染色(用于黏液染色)，在光學顯微鏡下以400倍放大倍數觀察并采集圖像。

2.4 檢測小鼠鼻腔灌洗液中炎癥因子水平

對小鼠鼻腔灌洗液進行炎癥因子檢測，根據ELISA試劑盒說明書，對三組小鼠鼻腔灌洗液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素(IL)4、IL-10和IL-17水平進行測定，重復3次。

2.5 鼻腔灌洗液中細胞分析

將鼻腔灌洗液150 μL以1 000 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)后涂片，利用Diff-Quik染色試劑盒進行染色，包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和上皮細胞，在光學顯微鏡下以400倍放大倍數觀察并采集圖像。

2.6 免疫熒光染色

將鼻中隔切片置于4 ℃、0.01 mo/L PBS緩沖液中，復溫15 min后滴加10%山羊血清+0.03% Triton X-100封閉液室溫(25 ℃)封閉2 h，組織切片中加入1∶ 400 OMP抗體，置于4 ℃孵育箱中過夜，再用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗。37 ℃下用異硫氰酸熒光素結合的山羊抗兔二級抗體孵育30 min，再次洗滌切片，滴加抗熒光衰減封片劑封片后置于4 ℃條件下保存，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 槲皮苷可改善AR小鼠的鼻過敏癥狀

治療組小鼠用槲皮苷灌胃，持續1周，記錄最后1次卵蛋白激發后的鼻摩擦次數和噴嚏次數。結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠平均鼻摩擦次數顯著增加(F=11.76，P<0.001)，而治療組小鼠平均鼻摩擦次數明顯少于模型組(F=9.89，P<0.01)；與對照組相比，模型組小鼠平均噴嚏次數顯著增加(F=13.21，P<0.001)，而治療組小鼠平均噴嚏次數明顯少于模型組(F=9.45，P<0.01)，差異均有統計學意義，表明槲皮苷可減輕AR小鼠的鼻過敏癥狀，見圖1。

A.各組小鼠平均鼻摩擦次數；B.各組小鼠平均噴嚏次數；與對照組相比，***P<0.001；與模型組相比，##P<0.01A. average number of nasal rubbing of mice in each group; B. average number of sneezing of mice in each group; vs. the control group, ***P<0.001; vs. the model group, ##P<0.01

3.2 槲皮苷可改善AR小鼠鼻中隔組織病理學形態

與對照組相比，模型組小鼠鼻中隔組織中有明顯的杯狀細胞增生，且黏液分泌活躍；與模型組相比，治療組小鼠鼻中隔組織中杯狀細胞增生減輕，黏液分泌減少，表明槲皮苷可改善AR小鼠鼻中隔組織病理學形態，見圖2。

A.HE染色；B.PAS染色A. HE staining; B. PAS staining

3.3 槲皮苷可降低AR小鼠鼻腔灌洗液中炎癥因子水平

與對照組相比，模型組小鼠鼻腔灌洗液中TNF-α(F=12.57)、IL-4(F=14.75)、IL-10(F=13.64)和IL-17(F=11.41)水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.001)；與模型組相比，治療組小鼠鼻腔灌洗液中TNF-α(F=10.43)、IL-4(F=9.87)、IL-10(F=9.70)和IL-17(F=8.43)水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，表明槲皮苷可抑制AR小鼠的炎癥反應，見圖3。

A.TNF-α；B.IL-4；C.IL-10；D.IL-17； 與對照組相比，***P<0.001；與模型組相比，##P<0.01A.TNF-α；B.IL-4；C.IL-10；D.IL-17； vs. the control group, ***P<0.001; vs. the model group, ##P<0.01

3.4 槲皮苷可減少小鼠鼻腔灌洗液中細胞數量

與對照組相比，模型組小鼠鼻腔灌洗液中總細胞數和分化細胞(包括上皮細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞)顯著增加；與模型組相比，治療組小鼠鼻腔灌洗液中細胞數量均明顯減少，見圖4。

3.5 槲皮苷可提高小鼠嗅覺上皮細胞中OMP表達水平

對照組小鼠嗅覺上皮細胞中的OMP表達正常，呈現濃綠色；模型組小鼠嗅覺上皮細胞中的OMP表達明顯減少；而治療組小鼠嗅覺上皮細胞中的OMP表達減少得到一定程度的扭轉，OMP表達增加，見圖5。

圖5 各組小鼠嗅覺上皮細胞中OMP免疫熒光染色代表性圖像

4 討論

AR為常見的變態反應性疾病，IgE抗體與肥大細胞和嗜堿性粒細胞結合，導致脫顆粒和釋放預先形成的介質，如組胺、白三烯和前列腺素D2，導致血管通透性增加，氣道平滑肌收緊，黏液分泌增加；另外，上述介質還可刺激感覺神經，在短時間內出現鼻癢、充血和打噴嚏的感覺，主要病理過程涉及免疫炎癥反應的過度激活等[10-11]。中重度AR患者需常年服用抗過敏藥以緩解癥狀，但長期服用抗過敏藥可能帶來諸多不良反應[12]。中醫藥是我國治療過敏性疾病的常用療法。研究結果表明，中醫藥治療AR具有一定的有效性[13]。但其中的作用機制尚無明確報道。

槲皮苷現已被證明具有多種治療作用，包括抗心腦血管疾病、免疫調節、神經保護、調節血脂、抗氧化及抗腫瘤等[14]。另有研究結果顯示，槲皮苷具有抗過敏作用，其可減輕特應性皮炎，可能機制為其具有抗炎和抗氧化活性[15]。本研究探討了槲皮苷在小鼠AR模型中的作用及相關機制，結果顯示,槲皮苷可有效減輕AR小鼠的過敏癥狀及黏液的產生。黏液分泌增多為變態反應的主要癥狀，IL-4可增強組胺誘導AR的黏液過度分泌[16-17]。IL-4是由肥大細胞和淋巴細胞產生的重要細胞因子，在過敏性哮喘和AR的發病機制中起著重要作用[18-19]。本研究結果說明槲皮苷可明顯減輕AR小鼠局部炎癥因子的產生，減輕局部炎癥細胞浸潤，由此表明槲皮苷可通過減少AR小鼠鼻腔灌洗液中IL-4等炎癥因子的表達進而減輕AR癥狀。

研究結果顯示，鼻黏膜上皮細胞中OMP表達的恢復與AR癥狀減輕密切相關，OMP是反映嗅覺損傷程度較為可靠的指標[20]。因此，本研究對各組小鼠嗅覺上皮細胞中OMP表達的變化進行研究，結果證實，槲皮苷治療后AR小鼠嗅覺上皮細胞中OMP的表達得到恢復，進一步說明槲皮苷對AR小鼠具有較好的治療作用。

綜上所述，槲皮苷對AR小鼠具有較好的治療效果，其可通過減輕炎癥反應、增加鼻黏膜上皮細胞OMP表達來發揮作用。本研究結果可為AR的臨床治療提供新的診療思路及研究基礎。