“血水同治”的桂枝茯苓丸治療子宮內膜異位癥網絡藥理學機制研究Δ

謝 韜，楊碧蓉，何培芝，周 華

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院婦科，上海 201203)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMT)指有活性的子宮內膜組織(腺體或間質)已經種植在子宮體外的疾病。臨床上常表現為漸進性加重性痛經、難治性不孕且極易復發等特點，嚴重影響患者的身心和生殖健康[1]。中醫認為，EMT的病理基礎為血瘀，多因風寒侵襲、經產留瘀、素性抑郁等導致離經之血蓄積胞中，瘀阻胞脈沖任，血不歸經，氣血津液運行失常，導致濕瘀互阻，積結日久，形成癥瘕包塊，治療以活血化瘀為大法。桂枝茯苓丸為經典的活血化瘀、消癥散結方，被稱為“消癥第一方”，首載于《金匱要略》，“婦人宿有癥病，經斷未及三月……所以血不止者，其癥不去故也，當下其癥，桂枝茯苓丸主之”[2]。

網絡藥理學認為，藥物治療疾病是在各藥物組成成分的干預下，經多靶點、多途徑實現共同干預[3]。尤其在中藥的藥理學研究領域，網絡藥理學分析較為常用和典型。中藥復方治療疾病遵循整體觀思想。而網絡藥理學具有整體性、系統性，并注重藥物間相互作用，與中醫藥學基本特點存在一定相似之處，符合中醫藥對疾病本質的認識[4-5]。本研究通過網絡藥理學方法，探討桂枝茯苓丸的靶點、活性成分和分子作用機制，希望進一步了解該藥在EMT治療領域的藥理機制，促進臨床合理用藥。

1 資料與方法

1.1 活性成分及其作用靶點的篩選

通過BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索出桂枝茯苓丸中桂枝、茯苓、赤芍、桃仁和牡丹皮5種中藥的化學成分及其相關靶點，并進行篩選，篩選標準：Score cutoff>20，AdjustedP-value<0.05。

1.2 EMT靶點的獲取

在GeneCards數據庫(http://www.genecards.org/)中搜索關鍵詞“endometriosis”，得到EMT相關靶點并進行記錄。

1.3 關鍵靶點篩選及構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡

應用R軟件(v4.0)將桂枝茯苓丸化學成分作用靶點和EMT相關的疾病靶點進行映射構建韋恩圖。存在交集的共同靶點可能是桂枝茯苓丸中活性成分治療EMT的關鍵靶點。以STRING數據庫 (http://string-db.org/)作為操作平臺，以共同靶蛋白為基礎，確定“Homosapiens”蛋白種屬，在“medium confidence”(>0.4)基礎上構建PPI網絡模型。

1.4 關鍵靶點基因功能注釋和通路富集分析

篩選出的共同靶基因的基因本體(GO)以R軟件(v4.0)進行功能注釋，所預測化學成分靶點的富集分析在京都基因與基因組百科全書(KEGG)平臺上進行操作，保留P≤0.01的結果，進行可視化處理，分析桂枝茯苓丸治療EMT可能的生物過程和信號通路。

2 結果

2.1 桂枝茯苓丸成分-靶點網絡的構建

共篩選出桂枝茯苓丸5味中藥51種類藥成分，其中，桂枝16種，茯苓18種，赤芍8種，桃仁3種，牡丹皮6種；共涉及823個靶點。

2.2 EMT疾病靶點的篩選及共同靶點PPI網絡構建

檢索GeneCard、BATMAN-TCM等數據庫，將獲取的靶點進行“去重”操作后得到1 600個不重復的疾病靶點。利用R軟件制作1 600個疾病靶點與823個桂枝茯苓丸類藥成分作用靶點的韋恩圖，獲得疾病-類藥活性成分共同靶點190個，見圖1。以STRING數據庫為操作平臺，對上述靶點進行分析，得到PPI作用網絡，見圖2。

圖1 中藥靶點基因和疾病靶點基因的交集韋恩圖

2.3 關鍵靶點GO生物功能注釋

應用R軟件中clusterProfiler包對桂枝茯苓丸成分-EMT疾病的190個共同作用靶蛋白進行GO生物功能注釋，根據保留P≤0.01的結果，進行可視化分析，得到GO分析柱狀圖，見圖3。可見，共同作用靶點主要富集在受體配體活性(receptor ligand activity)、激素活性(hormone activity)、生長因子活性(growth factor activity)、生長因子受體結合(growth factor receptor binding)、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding)和細胞因子活性(cytokine activity)等55個生物過程。表明桂枝茯苓丸可能通過調節受體配體活性及生長因子受體結合等方面治療EMT。

2.4 KEGG通路富集分析

應用R軟件中clusterProfiler包對桂枝茯苓丸成分-EMT疾病的190個共同作用靶蛋白進行KEGG通路富集分析，根據保留P≤0.01的結果，可視化分析，得到KEGG通路富集氣泡圖，見圖4。可見，共同靶點主要富集于非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)、美洲錐蟲病(chagas disease)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路(MAPK signalingpathway)、細胞因子間相互作用(cytokine-cytokin-ereceptorinteraction)和內分泌抵抗(endocrine resistance)等。

2.5 “藥物-成分-靶點”網絡調控圖

通過Cytoscape 3.2.1軟件繪制桂枝茯苓丸的“藥物-成分-靶點”網絡調控圖，見圖5；網絡拓撲圖分析見表1。圖5中，箭頭代表桂枝茯苓丸中的五味中藥，菱形代表五味中藥所含的各種成分，橢圓形代表相關靶點。結果顯示，桂枝茯苓丸通過5味中藥所含的47種成分作用于190個相關靶點治療EMT。

表1 網絡拓撲圖分析表

3 討論

3.1 EMT的病機和治療

EMT的發病機制較復雜，目前被廣泛接受的是“在位內膜決定論”，即子宮在位內膜細胞通過上皮間充質轉化具備了轉移侵襲的能力，進而與同種細胞脫離，穿過腹水或腹腔液、腹腔細胞和腹腔外基質三道防線進入腹腔完成異種細胞間的黏附，為進一步的侵襲和病灶血管形成奠定基礎[6-7]。現代醫學以手術和激素類藥物治療為主，但其應用有限。近年來，中醫藥在緩解EMT痛經、縮小包塊和促進生育方面療效顯著。

圖2 桂枝茯苓丸治療EMT的靶點基因PPI網絡圖

圖3 GO功能富集分析柱狀圖

3.2 桂枝茯苓丸的效用和現代藥理學探討

“血水同治”為桂枝茯苓丸治療EMT的典型療效，方中桂枝為君藥，味辛、甘，性溫，主通脈祛瘀、助氣行水；茯苓為臣藥，可利腰臍間血；桃仁味甘、性平，消癥且不傷正，協同茯苓共奏利水滲濕之功；芍藥柔肝調血；丹皮活血涼血消癥[8]。眾多醫家以該方為基礎治療EMT，獲得了滿意的臨床療效，至今仍被廣泛應用。現代藥理學研究結果證實，桂枝有抗病毒、抗菌、抗炎、抗凝、抗血小板聚集和抗過敏等療效[9]；茯苓有抗病毒、抗炎、抗氧化、保肝和利尿等功效[10]；赤芍有抗血栓、抗腫瘤、保肝和抗凝等療效[11]；桃仁有抗氧化、抗炎、活血祛瘀和促進血流動力學改善等療效[12]；牡丹皮能抗炎、抗菌，調節心血管系統。盡管現代藥理學對桂枝茯苓丸各成分的藥理作用有深入的研究，但是對于全方的藥理學機制和臨床治療EMT的作用機制卻少有報道[13]。

圖4 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖5 桂枝茯苓丸“藥物-成分-靶點”網絡調控圖

3.3 有效藥物成分的機制分析

本研究中發現，在中藥-成分-靶點-信號通路網絡中，苯乙烯、麥角胺、間羥基肉桂酸、八仙花酸和去氫齒孔酸的自由度高。但目前仍不了解上述藥物成分在EMT治療中發揮的作用，有待深入研究。

3.4 桂枝茯苓丸治療EMT的潛在靶點預測

在中藥-成分-靶點-信號通路網絡中，自由度高的靶點有CB1、CB2、ESR1和PGR1。CB1被發現主要表達于子宮、胎盤、睪丸以及中樞神經組織中[14]。CB2可表達于多種免疫細胞中。研究結果表明，2種大麻素受體均可參與EMT的細胞增殖、凋亡、黏附、侵襲和血管形成過程，進而影響EMT的發生發展[15]。大麻素受體還可調控異位子宮內膜組織的神經生長[16]。CB1和CB2在異位內膜中與磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路關系密切，可以通過抑制后者的活性起到抗細胞增殖的作用[17]。胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)信號通路可與PI3K/Akt信號通路相結合，共同參與CB激動劑甲烷甲酰胺增強子宮內膜間質細胞的遷移過程，研究檢測到經甲烷甲酰胺處理后的異位內膜中N-鈣黏蛋白及白細胞介素6的表達增加，提示CB1促進了異位內膜細胞的黏附、侵襲過程[18-19]。經遷移、黏附、侵襲以及心血管生成等變化后，異位子宮內膜可發展形成異位病灶。血管內皮生長因子(VEGF)是血管生成過程中的關鍵因子，大麻素受體已被證實能夠在多種惡性腫瘤細胞中有效阻斷VEGF通路，繼而抑制腫瘤血管生成[20]。

雌激素在EMT異位病灶中的水平高于同期血清水平，始終是異位病灶微環境中發病的關鍵因素[21]。高雌激素水平在EMT中發揮促進病灶細胞增殖、促進異位內膜細胞上皮間質轉化、促血管形成以及促進炎癥反應發生等作用[22]。因此，減少雌激素的合成對于EMT的治療具有重要作用。雌激素受體(ER)β可以誘導相關基因轉錄，從而促進誘導異位內膜細胞增殖[23]；并可以抑制腫瘤壞死因子α誘導的凋亡過程[24]。β-聯蛋白(β-catenin)反映上皮細胞間充質轉化，β-catenin主要作用于細胞骨架，能夠與上皮細胞的鈣黏蛋白構成復合體，對細胞間的相互黏附作用進行介導。研究結果指出，在EMT發病的初始階段，ER能夠與β-catenin的雌激素反應元件結合進而啟動β-catenin的轉錄，促進異位內膜細胞的EMT[25]。在異位病灶形成過程中，ER上調β-catenin轉錄激活了Wnt/β-catenin信號通路，后者能夠直接促進VEGF的轉錄，促進病灶周圍小血管的形成，為病灶形成提供物質基礎。

孕激素抵抗是EMT形成的重要機制，但抵抗的具體原因不完全明確[26]。Tanaka等[27]指出，在EMT中，雌激素和孕激素信號可以調節大麻素受體mRNA的表達，說明三者之間存在聯系，影響著EMT的發生發展。

ALOX5是炎癥介質白細胞三烯和脂氧素生成的一個起始酶，在腫瘤等疾病中通常表達量過高[28]。EMT為一種良性腫瘤，但其發病機制與一般的惡性腫瘤具有一定的相似性。孫平平等[29]認為，ALOX5在EMT組織中的高表達，與EMT發病存在一定關系，通過上調VEGF表達促進EMT新生血管形成。

綜合上述藥物作用的靶點，桂枝茯苓丸可能通過CB1、CB2、ESR、PGR和ALOX5等靶點調控EMT中異位內膜細胞的增殖抗凋亡、黏附、侵襲和血管生成的過程，從而起到治療EMT的作用。

3.5 桂枝茯苓丸治療EMT的潛在通路預測分析

從KEGG通路富集分析結果可知，在治療過程中可能涉及的主要通路為MAPK信號通路。MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在哺乳動物體內廣泛存在，并接受細胞外信號刺激，參與細胞增殖、分化、遷移以及衰老的過程；同時，其與炎癥、腫瘤等多種疾病的發生關系密切[30]。ERK1/2、c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38)和細胞外信號調節激酶5(ERK5)均為MAPK信號通路，且各分支通路的生物效能各不相同[31]。MAPK信號通路調節EMT中異位子宮內膜細胞黏附、侵襲、血管生成和抗凋亡的過程，參與EMT的發生發展[32]。MAPK信號通路還可促進異位內膜細胞的侵襲，主要作用機制為作用于多種細胞黏附分子介導的細胞黏附運動。侵襲過程涉及到細胞外基質的降解過程，基質金屬蛋白酶(MMP)是該過程中的主要酶類，多種因子可以通過通路間接調控MMP的表達，有利于異位侵襲種植。新生血管形成是EMT異位病灶形成的關鍵，異位病灶需要足夠的血液供應支持，并且其快速生長離不開大量新生血管的供應。在環氧合酶-2(COX-2)的誘導下，VEGF可加速合成，促進新血管的生成。Huang等[33]研究結果指出，EMT中過量表達的白細胞介素1β通過MAPK信號通路刺激COX-2的表達，間接促進了VEGF的表達。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學方法與技術，挖掘到桂枝茯苓丸中51種類藥性成分及823個潛在靶點，EMT相關靶點1 600個，其中桂枝茯苓丸-疾病共同靶點190個；進行GO生物分析初步預測出桂枝茯苓丸可能通過調節CB1、CB2、ESR、PGR和ALOX-5等靶點，通過KEGG通路富集分析和過程分析初步預測出桂枝茯苓丸可能通過調控MAPK信號通路，從而發揮抗炎、抗腫瘤和促凋亡等作用，從EMT中異位內膜細胞的黏附、侵襲和血管生成等病理過程干預，達到治療EMT的作用，對臨床治療具有重要意義。網絡藥理學是依托于已研究出的數據，借助各種平臺數據庫數據及配套的軟件算法進行分析，得出的結果可作為實驗研究的線索，其具體的作用機制還有待實驗研究證實。