基于HMGB1炎癥通路的甘草炮制雷公藤降低肝毒性的作用機(jī)制研究Δ

馬致潔，董捷鳴，于小紅，李 萌，陳 熹，趙奎君，饒 全#，章從恩#

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100050； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院普外科，北京 100050)

雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)的干燥根，因其毒性較大，傳統(tǒng)以外用為主，不予內(nèi)服，直至1974年首次將雷公藤內(nèi)服用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[1]。雷公藤作為一味經(jīng)典毒性中藥，古代醫(yī)籍中對(duì)其炮制方法的記載甚少，現(xiàn)代應(yīng)用時(shí)以凈制為主，去除毒性較大的外皮，取毒性較小的木質(zhì)入藥，但仍易出現(xiàn)不良反應(yīng)以及藥物性中毒事件[2-3]。同時(shí)，隨著皮部有效成分的丟失，其有效性也受到影響。微生物發(fā)酵炮制時(shí)，微生物中的酶系與雷公藤中的成分發(fā)生一系列有機(jī)反應(yīng)，容易改變?cè)谐煞只蛘咴黾右恍┬碌亩拘晕镔|(zhì)。在傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程中，由于菌種的不確定性和有毒菌株的混入，難以保障發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和安全性[4-5]。目前公認(rèn)的炮制減毒方法是以輔料炮制，但在雷公藤炮制減毒方面的研究較少。近期國(guó)內(nèi)學(xué)者也系統(tǒng)比較了不同炮制方法對(duì)雷公藤藥效和肝毒性的影響[6-9]。研究結(jié)果表明，在諸多炮制方法中，甘草汁炮制雷公藤增效減毒效果較佳，前期課題組已建立了甘草炮制雷公藤的方法，并證實(shí)了甘草炮制減毒的客觀性，但減毒機(jī)制仍未完全闡釋清楚[10-11]。

高遷移率族蛋白1(HMGB1)為存在于哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞核內(nèi)的蛋白。HMGB1可由激活的免疫細(xì)胞或壞死細(xì)胞釋放至胞外，通過(guò)Toll樣受體4(TLR4)和鈣調(diào)節(jié)通道介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫性疾病的發(fā)生[12-13]。在脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的肝損傷中，HMGB1被釋放至胞外，激活樹(shù)突狀細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[14-15]。課題組前期研究結(jié)果驗(yàn)證了雷公藤致大鼠肝損傷的機(jī)制可能與其激活了HMGB1-TLR4/核因子κB(NF-κB)炎癥通路有關(guān)[16-17]。本研究繼續(xù)探討甘草制雷公藤降低肝毒性與HMGB1介導(dǎo)的炎癥通路的關(guān)系，以期為闡釋甘草炮制雷公藤減毒的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，雄性，4～5周齡，體重(200±20)g，共24只(購(gòu)自華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：11401300054115)。將大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，4只/籠，保證大鼠有充足的活動(dòng)空間，期間維持室內(nèi)溫度為25 ℃左右、相對(duì)濕度為50±2%，每12 h進(jìn)行晝夜燈光交替1次。

1.2 儀器

XS205型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)；Centrifuge 5424R小型冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；CKX41型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；BS-300型自動(dòng)生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；SpectraMax?M3酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2型多功能旋渦混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)。

1.3 藥材與試劑

雷公藤購(gòu)自福建省三明市，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科趙奎君教授鑒定為衛(wèi)矛科雷公藤的干燥根莖；生甘草飲片(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古；生產(chǎn)批號(hào)：SB7131)購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥房。HMGB1(大鼠)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素(IL)1β、IL-2、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司；HMGB1(大鼠)抗體、TLR4(大鼠)抗體均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；NF-κB(大鼠)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；二抗(山羊抗兔鼠通用)購(gòu)自以色列Biological Industries生物科技公司；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒均購(gòu)南京建成生物工程研究所有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 雷公藤樣品的制備

稱取約2 500 g雷公藤生藥，切碎為大小約2～3 cm的不規(guī)則碎塊，取其中1/2(另1/2用于炮制)，按比例稱量8倍體積去離子水，用去離子水浸泡30 min；然后用電磁爐煎煮，輸出功率維持在1 000 W左右，煎煮40 min；然后用0.25 cm藥篩過(guò)濾，過(guò)濾后再次加入稱量好的8倍體積去離子水，再次煎煮40 min，以相同條件過(guò)濾，合并兩次濾液，將合并后的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，放入4 ℃冰箱，使用時(shí)再稀釋。

2.2 甘草炮制雷公藤樣品制備

2.2.1 甘草汁的制備：按雷公藤-甘草飲片質(zhì)量比3∶1來(lái)稱量所需的甘草片，以8倍體積的水提前浸泡甘草飲片30 min，然后煎煮20 min，用0.25 cm藥篩過(guò)濾，收集濾液；采用相同方法煎煮3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并后的濾液濃縮至合適體積，備用。

2.2.2 甘草制雷公藤樣品的制備：將上述另1/2已經(jīng)切碎為2～3 cm碎塊的雷公藤生藥稱量，分批放于1 000 mL燒杯里，加入制備好的甘草汁，以3∶1的質(zhì)量比浸泡雷公藤生藥，常溫(25 ℃)過(guò)夜，甘草汁需沒(méi)過(guò)雷公藤，使雷公藤充分吸收甘草汁。將浸泡過(guò)夜充分吸收甘草汁的雷公藤放入鍋內(nèi)，加熱并維持100 ℃，炒制10 min至雷公藤表面不粘手，得到甘草制雷公藤樣品。使用“2.1”項(xiàng)下方法制成甘草炮制雷公藤的水煎劑，臨用前配制成相應(yīng)濃度(給藥劑量以雷公藤生藥量計(jì))。

2.3 動(dòng)物分組與給藥

將24只SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為空白對(duì)照組、雷公藤組(相當(dāng)于生藥16 g/kg)和甘草炮制雷公藤組(相當(dāng)于雷公藤生藥16 g/kg)。給藥組大鼠連續(xù)灌胃給藥3周，空白對(duì)照組大鼠灌胃相同體積的0.9%氯化鈉溶液。

2.4 動(dòng)物取材及指標(biāo)檢測(cè)

每隔7 d于大鼠尾靜脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中肝臟生化指標(biāo)AST和ALT水平；末次給藥結(jié)束，取血檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子HMGB1、IL-1β、IL-2和TNF-α水平；末次給藥結(jié)束后(第21日)，取大鼠肝臟組織，一部分放入配好的福爾馬林里為蘇木精-伊紅(HE)染色切片備用；另一部分放入液氮中，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肝臟組織中HMGB1、TLR4和NF-κB的表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血清中ALT、AST含量檢測(cè)結(jié)果

給藥1周，空白對(duì)照組、雷公藤組和甘草炮制雷公藤組大鼠組間ALT、AST含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雷公藤組大鼠給藥2周后的血清ALT、AST含量高于空白對(duì)照組(P<0.05)，給藥3周后顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；同時(shí)雷公藤組大鼠給藥2周后的血清ALT、AST含量高于甘草炮制雷公藤組(P<0.05)，且給藥3周后顯著高于甘草炮制雷公藤組(P<0.01)，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。甘草炮制雷公藤組大鼠血清AST含量在給藥3周后高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ALT含量在不同給藥時(shí)間與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠血清ALT、AST含量的檢測(cè)結(jié)果比較

3.2 血清中炎癥因子檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組相比，雷公藤組大鼠的血清TNF-α、IL-1β和HMGB1含量均升高(P<0.01)，血清IL-2含量升高(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。甘草炮制雷公藤組大鼠與空白對(duì)照組上述血清炎癥因子含量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與雷公藤組相比，甘草炮制雷公藤組大鼠血清TNF-α、IL-1β和HMGB1含量明顯降低(P<0.01)，血清IL-2含量降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠血清炎癥因子檢測(cè)結(jié)果比較

3.3 肝組織中HMGB1炎癥通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組相比，雷公藤組大鼠肝臟中HMGB1、TLR4和NF-κB表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與空白對(duì)照組相比，甘草炮制雷公藤組大鼠TLR4、NF-κB表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甘草炮制雷公藤組大鼠HMGB1表達(dá)與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與雷公藤組相比，甘草炮制雷公藤組大鼠TLR4、NF-κB表達(dá)降低(P<0.05)，HMGB1表達(dá)顯著降低(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3、圖1。

A.空白對(duì)照組；B.雷公藤組；C.甘草制雷公藤組Note: A. blank control group; B. Tripterygium wilfordii group; C. licorice-processed Tripterygium wilfordii group

表3 三組大鼠肝臟組織中HMGB1通路相關(guān)蛋白條帶灰度值比值結(jié)果比較

3.4 肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

空白對(duì)照組大鼠肝臟組織HE染色均勻，肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，呈放射狀緊密排列，肝細(xì)胞形態(tài)良好；雷公藤組大鼠肝臟小葉排列紊亂，肝竇輕度擴(kuò)張，部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)圓形空泡和脂肪變性，局部區(qū)域出現(xiàn)點(diǎn)狀炎癥浸潤(rùn)灶；甘草炮制雷公藤組大鼠肝臟組織HE染色均勻，肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，呈放射狀排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)良好，無(wú)明顯肝損傷表現(xiàn)，見(jiàn)圖2。

A.空白對(duì)照組(×40)；B.空白對(duì)照組(×200)；C.空白對(duì)照組(×400)；D.雷公藤組(×40)；E.雷公藤組(×200)；F.雷公藤組(×400)；G.甘草炮制雷公藤組(×40)；H.甘草炮制雷公藤組(×200)；I.甘草炮制雷公藤組(×400)A.blank control group(×40)；B.blank control group(×200)；C.blank control group(×400)；D.Tripterygium wilfordii group(×40)；E.Tripterygium wilfordii group(×200)；F.Tripterygium wilfordii group(×400)；G.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×40)；H.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×200)；I.licorice-processed Tripterygium wilfordii group(×400)

4 討論

雷公藤在自身免疫性疾病尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的效果尤為顯著[17]。研究結(jié)果表明，低劑量使用雷公藤紅素具有顯著的減肥效果，應(yīng)用前景廣泛[18]。但由于雷公藤的活性成分同時(shí)也是其毒性成分，導(dǎo)致臨床應(yīng)用過(guò)程中極易出現(xiàn)不良反應(yīng)，近年來(lái)報(bào)道的藥物性肝損傷事件中，雷公藤位列單味中藥之首[19]。雷公藤的不良反應(yīng)限制了其在臨床中的應(yīng)用和發(fā)展，因此，雷公藤的減毒存效研究極為重要。在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，深入研究雷公藤毒性發(fā)生的機(jī)制，通過(guò)不同炮制配伍方法降低毒性，并保持或提高雷公藤的療效，是合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用雷公藤的重要課題。近年來(lái)，課題組一直致力于雷公藤的毒性及藥效學(xué)的研究。根據(jù)中藥藥性理論，甘味藥可以緩和藥性。甘草有“解百草毒”之名，“得中和之性，有調(diào)補(bǔ)之功”，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品[20]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提出“肝苦急，急食甘以緩之”，雷公藤的肝毒性可佐以甘草緩之，起到養(yǎng)護(hù)肝臟之效[21]。因此，利用甘草炮制雷公藤增效減毒符合中醫(yī)傳統(tǒng)理論。前期研究中，課題組發(fā)揮甘草汁炮制毒性中藥的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合甘草保肝的現(xiàn)代研究成果，開(kāi)展甘草汁炮制雷公藤降低肝毒性的研究，建立了甘草汁炮制雷公藤的方法，并證實(shí)了甘草炮制降低肝毒性的作用[10-11,16-17,22-23]。

HMGB1是一種重要的促炎因子，其主要受體為TLR和晚期糖基化終端產(chǎn)物受體[12]。研究結(jié)果表明，在多種肝損傷疾病中，HMGB1表達(dá)水平明顯升高。HMGB1在炎癥反應(yīng)中被釋放，遷移到胞外，與相應(yīng)受體特異性結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB入核，激活下游因子的表達(dá)，來(lái)促進(jìn)炎癥發(fā)生[24-28]。課題組前期已證實(shí)雷公藤的肝毒性與其激活HMGB1通路有關(guān)，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了甘草炮制雷公藤降低肝毒性與HMGB1通路的關(guān)系，為解釋甘草炮制雷公藤減毒的機(jī)制提供依據(jù)。當(dāng)

然，甘草炮制雷公藤減毒還有其他減毒的內(nèi)在機(jī)制，包括化學(xué)成分的改變、體內(nèi)靶點(diǎn)的改變等，需要繼續(xù)研究和探索。另外，在關(guān)注雷公藤減毒的前提下，也應(yīng)關(guān)注其藥理活性，在合理避毒的情況下，充分發(fā)揮雷公藤的強(qiáng)大免疫抑制能力才是最終目的，課題組后期會(huì)持續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究。