耐鹽異養硝化-好氧反硝化菌的篩選及特性研究

孫玲玉，顏家保，胡 杰，鮑彥舟

（武漢科技大學 化學與化工學院 煤轉化與新型炭材料湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430081）

氮含量超標將導致水體富營養化，并影響人體健康。傳統生物脫氮是利用微生物的硝化反硝化原理，將廢水中的NH首先在好氧條件下通過亞硝酸菌的作用氧化為NO，之后通過硝酸菌進一步氧化為NO，硝態氮在厭氧環境條件下通過反硝化菌還原為N。傳統生物脫氮理論認為，生物脫氮要經歷硝化（好氧）和反硝化（厭氧或缺氧）兩個階段，這兩個階段分別在不同的反應器中完成。基于此，開發了缺氧—好氧（A/O）、厭氧—缺氧—好氧（A-A/O）、缺氧—好氧—好氧（A/O-O）等工藝。

自ROBERTSON等首次從廢水脫硫和反硝化系統中分離出具有好氧反硝化能力的異養硝化菌泛營養硫球菌（Thiosphaera pantotroph）以來，越來越多的研究發現，自然界中還存在許多異養硝化-好氧反硝化菌。這些新菌種為異養菌，同時具備好氧硝化及反硝化功能。利用異養硝化-好氧反硝化菌可以在好氧環境中以有機物為碳源，脫除廢水中的氨態氮和硝態氮并同時去除廢水中的有機污染物。在同一反應器中同時脫除碳氮，大大節省了基建投資和運行成本。然而，目前分離得到的異養硝化-好氧反硝化菌主要來自淡水和鹽含量較低的環境，對于石油化工、生物醫藥、食品加工等行業排放的部分高含鹽污水，生物脫氮效率低，難以達到排放要求。

本研究從醫藥廢水生物處理活性污泥中分離得到1株耐鹽異養硝化-好氧反硝化菌Y1，并對其進行了種屬鑒定和脫氮特性研究，為高含鹽污水的生物脫氮提供了理論依據和技術參考。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

菌源取自湖北咸寧惠生醫藥廢水生物處理系統好氧段活性污泥。

LB培養基（g/L）：NaCl 10.0，蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，pH 7.2。

異養硝化培養基（g/L）：NaHPO·12HO 7.900，KHPO1.500，MgSO·7HO 0.100，（NH）SO0.943，CHNaO·6HO 18.000，FeSO·7HO 0.010，NaCl 50.000，微量元素2 mL，pH 7.4。該培養基理論NH-N質量濃度為200 mg/L。

好氧反硝化培養基（g/L）：以1.443 g/L KNO代替0.943 g/L （NH）SO，其余同異養硝化培養基。該培養基理論NO-N質量濃度為200 mg/L。

微量元素溶液配方見文獻。

蛋白胨和酵母提取物購自英國OXOID公司；其余試劑均為分析純。

QYC-211型恒溫搖床：上海福馬公司；1-14型離心機：德國SIGMA公司；UV2000型紫外-可見分光光度計：美國UNICO公司；HVE-50 型高壓蒸汽滅菌鍋：日本 HIRAYAMA公司；ABI3730XL型測序儀：美國賽默飛公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離

取活性污泥樣品于LB培養基中先進行活化和富集，將富集后的菌液分別接種到異養硝化和好氧反硝化培養基中進行硝化、反硝化及耐鹽性能馴化。

用稀釋涂布平板法對馴化后的菌株進行分離純化，并分別在異養硝化和好氧反硝化培養基中培養2 d，比較各菌株脫氮性能，選取硝化和反硝化綜合性能優異的菌株作為目標菌株，加入甘油保存。

1.2.2 菌種鑒定

依據《常見細菌系統鑒定手冊》，對于分離得到的目標菌株進行形態特征和理化特性鑒定。菌株基因組DNA的提取選用DNA試劑盒，采用16S rDNA特異引物進行PCR擴增，擴增產物委托武漢擎科生物技術有限公司進行16S rDNA測序。將測序結果上傳美國國家生物信息中心（NCBI）官網進行比對分析，確定細菌種屬。

1.2.3 菌株脫氮能力的影響因素

將菌株分別接種在異養硝化培養基和好氧反硝化培養基中，研究菌株在不同的鹽度（以NaCl質量分數計，鹽度最高值和最低值分別為菌株耐鹽能力的上限和下限）、碳源、m（C）∶m（N）、初始pH、培養溫度和搖床轉速下的脫氮能力。定期取樣測定培養基中的NH-N或NO-N質量濃度。

1.2.4 菌株在適宜條件下的脫氮性能

確定菌株適宜脫氮條件后，分別取菌液3 mL接種到異養硝化和好氧反硝化培養基，在適宜條件下培養48 h，定時取樣，測定培養液中的菌株生長量（以OD表征）及各形態氮的質量濃度。

1.3 分析方法

菌株生長量的測定采用光密度法；NH-N質量濃度的測定采用納氏試劑分光光度法； NO-N質量濃度的測定采用酚二磺酸紫外分光光度法；NO-N質量濃度的測定采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法；TN的測定采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法。

2 結果與討論

2.1 菌株的篩選與鑒定

經過馴化分離，得到7株耐鹽異養硝化-好氧反硝化菌株，將其編號為Y1~Y7，再分別對菌株Y1~Y7進行脫氮性能測試，各菌株的NH-N和NO-N去除率見圖1。由圖1可知，除Y2外，其他6株菌的NH-N和NO-N去除率均高于70%，其中菌株Y1的NH-N和NO-N去除率分別達到89.08%和87.27%，脫氮效率最高，因而選擇菌株Y1為目標菌株。

圖1 各菌株的NH4+-N和NO3--N去除率■ NH4+-N；■ NO3--N

圖2為菌株Y1的菌落形態和革蘭氏染色顯微照片。由圖2a可知，菌株Y1的菌落形態呈圓形且邊沿整齊，顏色為不透明的米黃色，表面光滑。由圖2b可知，菌株Y1呈紫色短桿狀，為革蘭氏陽性菌。生理生化試驗結果表明：接觸酶、硝酸鹽還原及亞硝酸鹽還原試驗呈陽性；乙醇發酵、甲基紅、淀粉水解、硫化氫及明膠液化試驗呈陰性。

圖2 菌株Y1的菌落形態（a）和革蘭氏染色（b）的顯微照片

對Y1進行16S rDNA測序，經NCBI比對分析，選取與菌株Y1同源性較高的部分菌株進行比較（見表1），發現其均為海桿菌屬（Marinobacter sp.）。結合菌株Y1的形態學特征、生理生化試驗結果，可以將其歸類為海桿菌屬（Marinobacter sp.）。菌株Y1的NCBI DNA序列數據庫（GenBank）登錄號為MZ831214。

表1 菌株Y1的16S rDNA序列比對結果

2.2 菌株脫氮的影響因素

2.2.1 鹽度

在培養溫度為30 ℃、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、m（C）∶m（N）=16、初始pH為9、搖床轉速為150 r/min的條件下，考察不同鹽度對菌株Y1去除NH-N和NO-N的影響，結果見圖3。由圖3可知：在36 h時，菌株Y1在3%~7% 鹽度下的NH-N、NO-N去除率均超過95%，而在9%和11%鹽度下的NH-N和NO-N去除率僅為20%~50%；隨著處理時間的延長，菌株Y1逐漸適應了高鹽環境，9%和11%鹽度下雖呈現不同程度的抑制，但最終的NH-N和NO-N去除率均超過99%；當鹽度繼續提高到13%時，菌株Y1無法再分解NH-N和NO-N；菌株Y1在5%鹽度下脫氮速率最快，30 h時的NH-N和NO-N去除率分別為99.21%和99.99%。以上結果表明菌株Y1在3%~11%鹽度范圍內均可生長并進行脫氮，最高耐受鹽度可達11%，適宜鹽度為5%。

圖3 鹽度對NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.2 碳源

碳源能為菌株的生長提供能量并為脫氮過程提供電子，但不同碳源對菌株脫氮的影響存在差異［10］。在鹽度為5%、m（C）∶m（N）=16、培養溫度為30 ℃、初始pH為9、搖床轉速為150 r/min的條件下，不同碳源對NH-N和NO-N去除率的影響見圖4。由圖4a可知：在異養硝化過程中，菌株Y1以丁二酸鈉和檸檬酸三鈉為碳源時，NH-N在6~36 h內快速分解，36 h 后的NH-N去除率均超過99%；當碳源為蔗糖和葡萄糖時，NH-N的去除率相對較低（<75%）。由圖4b可知：好氧反硝化過程中，以葡萄糖、檸檬酸三鈉為碳源時，30 h 時的NO-N去除率分別為99.14%和92.78%；而以丁二酸鈉、蔗糖為碳源時，NO-N的去除率相對較低。以上結果表明異養硝化過程中丁二酸鈉為碳源時的脫氮效果最好，好氧反硝化過程以葡萄糖為碳源時的脫氮效果最好。

圖4 碳源對NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.3 m（C）∶m（N）

在鹽度為5%、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、培養溫度為30 ℃、初始pH為9、搖床轉速 為150 r/min的條件下，考察m（C）∶m（N）對NH-N和NO-N去除率的影響，結果見圖5。由圖5可見：當m（C）∶m（N）分別為4和8時，NH-N去除率分別為46.89%和82.17%，NO-N去除率分別為27.68%和64.32%，這是由于碳源含量較低時菌株Y1不能充分生長，脫氮效率低；當m（C）∶m（N）提高至12時，菌株Y1在36 h時的NH-N去除率高達99.79%，但NO-N的去除仍受到部分抑制，這是由于反硝化過程利用有機碳源作為電子供體，需要更高的m（C）∶m（N）；當m（C）∶m（N）達到16時，NH-N、NO-N的去除率均超過99%。當m（C）∶m（N）進一步提高至20時，過高的m（C）∶m（N）使得菌株Y1生長代謝不平衡，NH-N、NO-N的去除率不再提高。結合菌株Y1的硝化、反硝化脫氮效果，選擇適宜的m（C）∶m（N）為16。

圖5 m（C）∶m（N）對NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.4 初始pH

pH能通過影響細胞膜的通透性和酶的活性等來影響微生物的生長和代謝。在鹽度為5%、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、 m（C）∶m（N）=16、培養溫度為30 ℃、搖床轉速為150 r/min的條件下，初始pH對NH-N和NO-N去除率的影響見圖6。由圖6可知，當初始pH為8~10時，菌株Y1在異養硝化36 h時的NH-N去除率超過99%，反硝化過程在24 h 時的NO-N去除率也達99%以上，表明弱堿性環境更有利于菌株Y1的生長和脫氮。當初始pH為7時，菌株Y1的NH-N、NO-N的去除率降低，去除速率均有所變慢。當pH=6時，Y1培養24 h的NH-N去除率僅為28.80%，去除速率明顯減慢，反硝化過程受到嚴重抑制。表明菌株Y1的適宜初始pH為8~10。

圖6 初始pH對NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.5 培養溫度

在鹽度為5%、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、m（C）∶m（N）=16、初始pH為9、搖床轉速 為150 r/min的條件下，考察培養溫度對NH-N和NO-N去除率的影響，結果見圖7。由圖7可知：異養硝化過程中，當培養溫度為20~40 ℃時，菌株Y1在培養48 h后的NH-N去除率超過99%；好氧反硝化時，隨著溫度的升高，NO-N去除率呈現先升高后降低趨勢，且當溫度為25 ℃和30 ℃時NO-N的去除率皆達到97%以上，原因是溫度過高或過低時均會影響菌株的生長代謝。相較于異養硝化過程，反硝化過程對溫度的變化更為敏感，這可能是由于反硝化過程中相關酶對溫度要求更為嚴苛。菌株Y1在30 ℃時NH-N和NO-N的去除率最高。

圖7 培養溫度對NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.6 搖床轉速

搖床轉速是影響培養基中溶解氧濃度的主要因素，提高搖床轉速可增大溶解氧濃度。在鹽度為5%、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、m（C）∶m（N）=16、初始pH為9、培養溫度為30 ℃的條件下，考察搖床轉速對NH-N和NO-N去除率的影響，結果見圖8。由圖8可知：在50~250 r/min轉速下，NH-N和NO-N去除率隨著搖床轉速的提高而加快。當搖床轉速為50 r/min時，NH-N和NO-N的去除率均不超過30%，低轉速下培養基中溶解氧濃度低，菌株Y1生長速率受到抑制、脫氮效率低；當搖床轉速增至150~250 r/min，菌株Y1的NH-N、NO-N去除率均超過99%；搖床轉速為250 r/min時，NH-N和NO-N的去除效果與200 r/min幾近相同。因此適宜的搖床轉速為150~200 r/min。

圖8 搖床轉速對NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.3 菌株的脫氮特性

2.3.1 異養硝化特性

將菌株Y1在上述優化條件下以異養硝化培養基培養48 h，培養液的OD及各形態N的質量濃度見圖9。由圖9可知：在0~6 h，菌株Y1生長緩慢，NH-N和TN只有少量被降解；6 h后菌株Y1的生長量開始呈對數增長，同時NH-N和TN的濃度快速降低，至24 h時ρ（NH-N）和ρ（TN）分別為1.21 mg/L和23.21 mg/L，去除率分別達到99.31%和88.14%；整個異養硝化過程幾乎沒有NO-N的積累；NO-N于24 h出現最大積累量（16.23 mg/L），隨后被立即去除。這可能是由于硝酸鹽還原酶活性較低，致使硝化過程中NO-N的積累大于反硝化時NO-N的消耗，而亞硝酸鹽氧化酶活性較強，在硝化過程中NO-N快速轉化為NO-N。TN的減少說明氨態氮最終被轉化為氮氣或氮氧化物，菌株Y1在進行異養硝化反應的同時也進行了反硝化反應，表現出同步硝化反硝化優勢。

圖9 優化條件下菌株Y1異養硝化培養液的OD600及各形態N的質量濃度

2.3.2 好氧反硝化特性

將菌株Y1在上述優化條件下以好氧反硝化培養基（初始NO-N質量濃度為189.38 mg/L）培養48 h，培養液的OD及各形態N的質量濃度見圖10。由圖10可見：菌株Y1培養6 h后進入對數生長期；6~12 h時NO-N和TN的質量濃度快速減少，分別從184.67 mg/L和201.25 mg/L降至42.36 mg/L和66.50 mg/L，平均降解速率分別達到23.72 mg/（L·h）和22.46 mg/（L·h）；NO-N的快速降解導致NO-N轉化不及時并于12 h出現少量積累（2.91 mg/L），但隨后被立即去除；菌株Y1經24 h到達生長穩定期，此時NO-N和TN的質量濃度分別為10.67 mg/L和23.25 mg/L，去除率分別達到94.37%和89.36%，表明菌株Y1對NO-N和TN有良好的反硝化去除能力；繼續培養至36 h，菌株Y1因培養基營養不足進入衰亡期，幾乎不再進行脫氮。

圖10 優化條件下菌株Y1好氧反硝化培養液的OD600及各形態N的質量濃度

3 結論

a）從醫藥廢水生物處理好氧段活性污泥中分離得到1株耐鹽異養硝化-好氧反硝化菌株Y1，鑒定為海桿菌（Marinobacter sp.）。

b）菌株Y1適宜的脫氮條件為：鹽度5%，異養硝化以丁二酸鈉為碳源，好氧反硝化以葡萄糖為碳源，m（C）∶m（N）=16，初始pH=8~10，培養溫度30 ℃，搖床轉速150~200 r/min。

c）適宜條件下，異養硝化過程中NH-N和TN的去除趨勢相同，24 h去除率分別為99.31%和88.14%；好氧反硝化過程中NO-N和TN的去除基本同步，24 h去除率分別為94.37%和89.36%。硝化和反硝化過程中分別出現了少量的NO-N和NO-N的積累，隨后被立即去除，表明菌株Y1在高鹽度環境下仍具有良好的同步硝化反硝化脫氮潛能。