Beclin 1介導NS5ATP9對饑餓誘導的HepG2細胞凋亡的作用

全敏 邢卉春

NS5ATP9是丙型肝炎病毒(HCV)非結構蛋白5A(NS5A)反式激活基因，在多種惡性腫瘤細胞及癌組織中高表達，參與腫瘤細胞增殖和凋亡，DNA損傷后修復等[1-4]。研究發現，NS5ATP9在細胞饑餓時表達增加，有抑制肝母細胞瘤細胞凋亡的作用，此外其可以上調Beclin 1的表達，促進肝母細胞瘤細胞增殖，而Beclin 1與多種腫瘤發展關系密切，抑制Beclin 1表達能增強肝癌對抗腫瘤藥物的敏感性[5-8]。本實驗探討Beclin 1是否參與了NS5ATP9抑制饑餓誘導的肝母細胞瘤細胞凋亡的作用。

材料與方法

一、實驗材料

肝母細胞瘤細胞系HepG2細胞[9]及pcDNA3.1/myc-His(-)-NS5ATP9(pNS5ATP9)表達載體及對照空載體pcDNA3.1/myc-His(-)(pNC)均為本實驗室保存。NS5ATP9 siRNA(si-NS5ATP9)和Beclin 1 siRNA(si-Beclin 1，sc-29797) 和各自的對照載體(二)si-NC由santa Cruz公司合成[10]。 細胞培養基(DMEM)、平衡鹽溶液EBSS及胎牛血清購自美國Gibco公司；轉染試劑盒jetPRIMETM購自美國Polyplus Transfection公司；caspase-Glo○R3/7試劑盒購自美國Promega公司。

二、實驗方法

(一)細胞培養及重組質粒轉染 HepG2細胞用DMEM(含10%胎牛血清)于體積分數為0.05的CO2孵箱中培養，根據說明書轉染重組質粒或siRNA及相應對照。

(二)細胞總蛋白抽提 細胞裂解液(5872 s, CST, 美國)裂解細胞，提取總蛋白，完成蛋白定量。用12% NUPAGE Bis-Tris凝膠電泳(NP0034，Invitrogen，Grand Island，美國)。然后轉移至PVDF膜(ISEQ00010，Milipore，Billerica，美國) ；用5%脫脂奶粉配置1×TBST封閉液，依次與一抗Beclin 1 抗體 (3495，CST，美國)、NS5ATP9抗體 (ab56773，Abcam, 香港)、GAPDH 抗體(5174，CST)、bax 抗體(2772，CST，美國)、β-Actin 抗體(4967，CST，美國)及二抗反應。最后顯色，置于成像儀下曝光顯影，保存圖像。

(三)胱冬肽酶-3/7酶活性檢測 caspase-3作為凋亡過程中的關鍵執行分子，通過caspase-3/7活性檢測可反映細胞凋亡的程度。按照試劑盒操作檢測caspase-3/7活性。

三、統計學方法

應用SPSS 26.0軟件統計分析。組間兩兩比較采用單因素方差分析，以P<0.05代表差異有統計學意義。每個實驗至少重復3次，數據以均數±標準差表示。

結 果

一、NS5ATP9與bax蛋白表達

EBSS培養細胞0、6、12、18、24 h后，提取細胞總蛋白，蛋白質印跡檢測NS5ATP9、Beclin1、bax蛋白表達量的變化。隨著饑餓時間的延長，NS5ATP9蛋白表達量逐漸升高，bax的表達呈升高趨勢(圖1)。

圖1 饑餓HepG2細胞6、12、18、24 h后，NS5ATP9蛋白表達升高，bax蛋白表達升高

二、NS5ATP9表達增加或抑制后，bax表達量呈相反變化

將si-NS5ATP9或pNS5ATP9轉染HepG2細胞48 h，EBSS饑餓細胞24 h，提取總蛋白檢測NS5ATP9、bax蛋白表達量的變化。NS5ATP9表達增加組bax的表達量有下調趨勢，NS5ATP9表達抑制組bax蛋白表達量有上調趨勢(圖2)。

注：pNS5ATP9(+表示pNS5ATP9轉染組，-表示對照載體轉染組)；si-NS5ATP9(+表示si-NS5ATP9轉染組，-表示對照si-NC轉染組)

三、Beclin 1表達被抑制后，NS5ATP9對凋亡的抑制作用減弱

在轉染si-Beclin 1 24 h后再轉染NS5ATP9過表達載體(pNS5ATP9)24 h，EBSS培養細胞24 h。與對照組相比，si-Beclin 1轉染組，caspase-3/7活性顯著增加；與對照組相比，pNS5ATP9轉染組，caspase-3/7活性顯著降低；在pNS5ATP9轉染的兩組組內比較，si-Beclin 1轉染組caspase-3/7活性顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 pNSATP9及si-Beclin 1轉染HepG2細胞后caspas3/7相對活性變化

四、Beclin 1表達被抑制后，NS5ATP9對bax下調作用減弱。

在HepG2 細胞內轉染si-Beclin 1 24 h后轉染NS5ATP9過表達載體(pNS5ATP9)24 h，EBSS培養細胞24 h。與對照組相比，NS5ATP9過表達組bax的表達量減少。

在si-Beclin 1轉染的兩組組內比較，NS5ATP9過表達組bax表達量減低，在NS5ATP9過表達的的兩組組內比較，si-Beclin 1轉染組，bax表達量增加。說明Beclin 1被抑制后，削弱了NS5ATP9對HepG2細胞凋亡的抑制作用(圖3)。

圖3 先后轉染si-Beclin 1及pNS5ATP9 24 h后，饑餓HepG2細胞24 h bax蛋白表達量

討 論

NS5ATP9在肝癌組織較癌旁組織及正常肝組織中表達明顯升高，與肝癌的分期、惡性程度、不良預后相關，尋找NS5ATP9在肝癌細胞凋亡中的作用及機制對防治肝癌有重要價值[11-13]。

NS5ATP9可以上調Beclin 1介導饑餓誘導的細胞自噬[6, 10]，并有抑制饑餓誘導的HepG2細胞凋亡的作用[5]。腫瘤生長過快會出現營養缺乏的狀態，探索饑餓狀態下肝癌細胞抗凋亡的機制對抗腫瘤有幫助。bax基因是一種促凋亡基因，bax變化與凋亡水平相一致。本研究發現，隨著HepG2細胞饑餓時間延長，bax蛋白表達量與NS5ATP9均有升高趨勢。前期研究結果已明確NS5ATP9在饑餓時的表達增加對HepG2細胞凋亡有抑制作用[5]。本研究結果顯示在饑餓HepG2細胞的同時抑制NS5ATP9的表達，再次檢測bax的蛋白表達升高，caspas3/7活性也相應增強，證實在饑餓狀態下NS5ATP9的高表達會下調bax的表達。

Beclin 1 在不同腫瘤中的作用并不一致，有研究應用肝癌組織基因芯片，發現Beclin 1 mRNA在肝腫瘤組織和肝癌細胞中表達明顯高于正常肝組織及肝細胞[14]。本研究在抑制Beclin 1表達后再次檢測NS5ATP9對HepG2細胞caspas3/7活性和bax表達的影響，結果顯示caspas3/7活性增強，并且bax表達增加。然而抑制Beclin 1并沒有完全阻抑NS5ATP9對HepG2細胞凋亡的抑制作用，推測Beclin 1部分參與了NS5ATP9對HepG2細胞凋亡的抑制作用。Beclin 1在抗肝癌的研究中也是熱點基因[15]，褪黑素可通過抑制PERK-ATF4-Beclin 1抑制自噬，增強肝癌對索拉非尼的敏感性[7]。另有研究顯示，FTY720(抗腫瘤藥物)與si-Beclin 1共轉染肝癌細胞后，肝癌細胞對FTY720的敏感性增加[8]。本研究發現Beclin 1在NS5ATP9抑制饑餓誘導HepG2細胞凋亡中所起的作用，為未來Beclin 1作為靶點基因在抗肝癌藥物中的應用提供參考價值。