乙型肝炎病毒耐藥突變位點(diǎn)與基因型及肝硬化相關(guān)性研究

鄭璟 彭燕燕

目前核苷(酸)類(lèi)似物(NA)是治療慢性乙型肝炎主要藥物，強(qiáng)效低耐藥藥物如恩替卡韋(ETV)、替諾福韋酯(TDF)、丙酚替諾福韋(TAF)等已經(jīng)作為臨床初治患者的首選。NA在臨床應(yīng)用中嚴(yán)重不良反應(yīng)較為少見(jiàn)，但HBV可在抗病毒藥物壓力下獲得適應(yīng)性變異，誘導(dǎo)HBV聚合酶基因反轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)域的耐藥突變，使抗病毒藥物敏感性下降，導(dǎo)致治療失敗[1]。研究表明耐藥突變位點(diǎn)與基因型可能存在一定關(guān)聯(lián)[2,3]，但尚無(wú)明確定論。本研究通過(guò)檢測(cè)RT區(qū)域的耐藥突變位點(diǎn)，分析其與不同HBV基因型、疾病進(jìn)程(慢性乙型肝炎與肝硬化)的相關(guān)性，為臨床病情分析及抗病毒藥物的選擇提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

2015年10月至2019年10月汕頭市中心醫(yī)院門(mén)診及住院乙型肝炎患者391例，男290例，女101例。其中慢性乙型肝炎患者342例，肝硬化患者43例，肝衰竭患者4例和肝癌患者2例。診斷符合2015版《慢性乙型肝炎防治指南》，排除甲、丙、丁、戊、庚等其他類(lèi)型肝炎病毒感染、藥物性肝炎、酒精性肝炎及自身免疫性肝炎等可導(dǎo)致肝臟病變的疾病。入組患者均經(jīng)過(guò)NA治療。本研究通過(guò)汕頭市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、研究方法

(一) HBV基因型及耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè) 清晨抽取患者靜脈血，4 000 r/min離心5 min分離血漿，置4℃冰箱保存。外送至廣州達(dá)安臨檢中心檢測(cè)，采用HBV耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒(深圳亞能生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增，最后在深圳亞能YN-H16分子雜交儀上進(jìn)行雜交顯色。

(二)HBV基因型及耐藥位點(diǎn)結(jié)果判讀 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因型及耐藥位點(diǎn)顯色結(jié)果分析，包括常見(jiàn)基因型B、C、D型及6種NAs常見(jiàn)耐藥突變位點(diǎn)(野生型：rt180L、rt204M、rt207M、rt207V、rt181A、rt236N；突變型：rt180 M、rt204V、rt204I、rt207I、rt181V、rt236T)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS V19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。不同基因型組之間、慢性乙型肝炎與肝硬化組之間不同耐藥位點(diǎn)突變率的比較采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，若1≤理論頻數(shù)<5時(shí)，采用連續(xù)校正卡方檢驗(yàn)；當(dāng)理論頻數(shù)<1時(shí)，用Fisher確切概率法計(jì)算概率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基因型與耐藥突變位點(diǎn)的關(guān)系

391例乙型肝炎患者中B基因型345例，其中103例有耐藥位點(diǎn)突變，C基因型46例，13例有耐藥位點(diǎn)突變；D基因型為0例。在HBV常見(jiàn)6個(gè)耐藥位點(diǎn)中C基因型的rtL180M耐藥突變率高于B基因型，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而兩種基因型的其他耐藥位點(diǎn)突變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表1。進(jìn)一步分析116例聯(lián)合突變模式的構(gòu)成比，rtL180M+rtM204V在基因型C中的比例(6/13)顯著高于基因型B(16.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 HBV常見(jiàn)六個(gè)耐藥位點(diǎn)突變率與不同基因型的關(guān)系[例(%)]

表2 B和C基因型中聯(lián)合突變模式構(gòu)成比[例(%)]

二、HBV常見(jiàn)6個(gè)耐藥位點(diǎn)突變率與慢性乙型肝炎、肝硬化的關(guān)系

選取慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，位點(diǎn)rtA181V在肝硬化患者中的突變率(7.0%)顯著高于慢性乙型肝炎患者(0.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他突變位點(diǎn)rtL180M、rtM204V、rtM204I、rtV207I、rtN236T在突變型與野生型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 HBV常見(jiàn)6個(gè)耐藥位點(diǎn)突變率與慢性乙型肝炎、肝硬化關(guān)系[例(%)]

討 論

由于HBV復(fù)制極其活躍并缺乏反轉(zhuǎn)錄酶校對(duì)功能，具有高變異性，在藥物選擇下產(chǎn)生的耐藥突變?nèi)菀讓?dǎo)致病情反復(fù)，造成臨床治療困難。HBV RT區(qū)基因位點(diǎn)的突變與基因型、不同病程的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜[4]。

本研究結(jié)果表明，基因型C型HBV的位點(diǎn)rtL180M和rtM204V+rtL180M的突變率高于基因型B型，與以往研究相一致。 Zhang等[5]報(bào)道，相比基因型B型，基因型C型中rtL180M具有更高的突變率(54.7%比36.1%,P=0.002)。Ma等[2]報(bào)道，rtL180M和rtM204V+rtL180M突變?cè)诨蛐虲型中更為常見(jiàn)。研究表明，HBV RT區(qū)核苷酸類(lèi)似物耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變對(duì)HBV基因型具有偏向性。HBV基因組由不完全環(huán)狀雙鏈DNA構(gòu)成，包括P區(qū)、S區(qū)、C區(qū)與X區(qū)四個(gè)開(kāi)放閱讀框，P區(qū)主要包括反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、末端蛋白、非編碼間隔區(qū)及RNA酶H區(qū)。由于RT區(qū)和S基因具有相同的DNA序列，RT區(qū)的變異也可以引起S基因的改變。有研究顯示，rt180的沉默突變導(dǎo)致了S基因的錯(cuò)義突變，即RT區(qū)中rt180位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致HBsAg中172 Trp>Ser (W172S)的突變[6]。而S突變可能通過(guò)不同的途徑引起肝臟疾病，導(dǎo)致包膜蛋白和病毒顆粒的積聚和誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而促進(jìn)HBV免疫逃逸和原發(fā)性肝癌的發(fā)展。本研究中rtM204V+rtL180M互補(bǔ)突變組合在基因型C型中的比例顯著高于B 型。有報(bào)道顯示rtL180M能作為補(bǔ)償性突變與rtM204V共同作用而增強(qiáng)病毒的復(fù)制能力，增加機(jī)體罹患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)[7,8]。因此，相對(duì)于基因型B型，對(duì)基因型C型患者的突變位點(diǎn)檢測(cè)及病情進(jìn)程監(jiān)測(cè)可能更顯重要。

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道了較多的rtA181V/T與肝細(xì)胞癌關(guān)系研究[9,10]，而對(duì)rt181位點(diǎn)與肝硬化關(guān)系研究較少。有文獻(xiàn)報(bào)道，rt181位點(diǎn)突變的出現(xiàn)不僅增加了慢性乙型肝炎轉(zhuǎn)變成為肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)，而且肝硬化是這一突變發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，rtA181V在使用過(guò)NA治療肝硬化患者中的突變率顯著高于慢性乙型肝炎患者，提示rtA181V的出現(xiàn)與肝硬化風(fēng)險(xiǎn)的增加密切相關(guān)。rtA181T突變和rtA181V突變的變異存在不同之處：rtA181T突變導(dǎo)致S區(qū)sW172*取代，提前產(chǎn)生終止密碼子，具有HBsAg和病毒粒子分泌缺陷可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終導(dǎo)致肝臟疾病[12-15]；而rtA181V變異后可引起表面抗原出現(xiàn)氨基酸的置換，S基因173位亮氨酸被置換變異為苯丙氨酸，并不引起表面抗原的截短或缺失[16]，該位點(diǎn)對(duì)于肝硬化發(fā)生機(jī)制的影響還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。抗病毒治療后發(fā)生肝硬化的患者肝細(xì)胞癌發(fā)生率更高，因此，及時(shí)監(jiān)測(cè)慢性乙型肝炎經(jīng)治患者中rtA181V突變，對(duì)于調(diào)整臨床治療策略降低病情惡化概率具有一定臨床意義。

綜上所述，HBV基因不同位點(diǎn)的耐藥突變率與不同基因型和肝硬化相關(guān)。在病情早期檢測(cè)不同耐藥突變位點(diǎn)和基因型，能為臨床病情監(jiān)測(cè)及選擇合適藥物提供參考，有助于減少因耐藥而導(dǎo)致治療效果不佳的情況，最終使患者受益。