超高效液相色譜-串聯質譜法測定烏骨雞中23 種磺胺類藥物殘留

謝慧英，李娟，于暉，周鴻

江西省疾病預防控制中心，江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室，江西 南昌 330029

烏雞白鳳丸具有補氣養血和調經止帶的功效，是治療婦科疾病的“三大圣藥”之一［1］，收載于《中國藥典》2020 年版一部，其配方主要原材料為烏骨雞，約占制劑用量的25%［2］，烏骨雞的品質直接影響烏雞白鳳丸的藥用功效。目前烏骨雞主要以人工養殖為主，在養殖過程中常使用磺胺類藥物抵御病蟲害［3］，不合理用藥會導致烏骨雞存在藥物殘留［4］，并傳遞到人體，危害人體健康。因此，準確測定烏雞白鳳丸原料中烏骨雞的藥物殘留，對烏雞白鳳丸的用藥安全有著十分重要的意義。

傳統磺胺類藥物檢測方法有液相色譜法和液相色譜串聯質譜法等［5-7］，樣品前處理過程相對繁瑣、靈敏度不高、抗干擾能力差，難以滿足23 種磺胺類藥物同時測定的需要。藥物殘留前處理方法有液液萃取、固相萃取、加速溶劑萃取和分散固相萃取等方法［8-11］。其中分散固相萃取具有快速簡便和高效可靠的特點，在磺胺類藥物分析中已有相關報道［12-15］，而在烏骨雞中藥物殘留分析報道較少。本實驗以磺胺類藥物為研究對象，采用碳納米管結合分散固相萃取，建立了測定烏骨雞中23 種磺胺類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜方法，以促進烏骨白鳳丸藥業的發展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30A 超高壓液相色譜儀（日本島津公司）；Sciex QTRAP 5500 質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；高速低溫離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；多孔渦旋振蕩器（德國Heidolph 公司）；Milli-Q 超純水系統（美國Millipore 公司）；電子天平（瑞士Metter Toledo）。

23 種磺胺混合標準溶液（100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）；多壁碳納米管（MWCNTs，南京吉倉納米科技有限公司）；無水硫酸鈉、C18 和PSA（天津博納艾杰爾公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色譜級，美國Merck 公司）；乙酸銨（色譜級，上海阿拉丁公司）；烏骨雞來源于商場、農貿市場和網店。

1.2 標準溶液的配制

移取適量的23 種磺胺類藥物標準溶液，加入甲醇配制成5.0 mg/L 混合標準儲備液，在-20 ℃保存；選取空白樣品2.00 g，按“1.3”項下的方法制備空白基質提取液，用空白基質提取液逐級稀釋混合標準儲備液，配制成1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL 的基質匹配混合標準系列，于4 ℃保存。

1.3 樣品溶液的制備

稱取2.00 g 樣品于50 mL 離心管中，加入1%（體積分數）甲酸的乙腈10 mL，渦旋振蕩30 min，以8 000 r/min 于4 ℃離心10 min，取出4 mL 上清液，加入100 mg C18、50 mg PSA、20 mg MCNTs和500 mg 無水硫酸鈉，渦旋1 min，以10 000 r/min于4 ℃離心10 min，吸取2 mL 上層清液，氮吹干至近干，加入1 mL 初始流動相，復溶，渦旋混勻1 min，過0.22 μm 濾膜，備用。

1.4 色譜與質譜條件

液相色譜條件：BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣體積為2 μL；流速：0.3 mL/min。流動相A：含0.1%（v/v）甲酸的1 mmoL/L 乙酸銨水溶液，流動相B：甲醇。梯度洗脫程序:0～1.0 min,10% B；1.0～7.0 min，10% B～45% B；7.0～12.0 min，45% B～95% B；12～14 min，95% B；14.1～16 min，10% B。

質譜條件：離子源正離子模式（ESI+）；多反應監測；氣簾氣：35.0 L/h；霧化氣：50.0 L/h;加熱輔助氣流量：50.0 L/h；離子噴霧電壓：+5 500 V；離子源溫度：500 ℃；其他質譜條件見表1。

表1 質譜參數

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

本實驗待測的磺胺類藥物中，包含相同的母離子和子離子同分異構體，這些同分異構體需在色譜中分離，避免相互干擾。考慮待測化合物的保留時間、峰型和質譜響應等因素，選定含0.1%（v/v）甲酸的1 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇作為流動相體系。在該體系下，磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧達嗪和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺二甲異嘧啶和磺胺二甲嘧啶，磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶，3 組同分異構體藥物均實現了色譜分離。圖1 為3 組同分異構體藥物的色譜圖。

圖1 3組同分異構體的MRM色譜圖

2.2 提取溶劑和凈化條件的選擇

由于乙腈沉淀蛋白的能力優于甲醇和丙酮等常用提取溶劑，選用乙腈為提取溶劑，并加入1%甲酸以提高磺胺類藥物的提取效率［14］。由于烏骨雞中含有大量蛋白質、色素和有機酸等物質，如果前處理凈化過程中未除去這些干擾物，將影響目標物的定量分析，污染離子源。在樣品中加入C18 可消除脂類的干擾，加入PSA 可除去有機酸和金屬離子等干擾，加入MCNTs 可去除色素，本實驗將三種材料混合使用以達到最佳凈化效果。分別考察了不同比例組成的凈化劑對23 種藥物凈化效果的影響。實驗結果表明，選用100 mg C18、50 mg PSA 和20 mg MCNTs 為凈化劑能達到凈化目的。

2.3 基質效應、檢出限、定量限及加標回收率

采用基質曲線標準溶液與溶劑標準溶液中磺胺類藥物的響應百分比減去100 的差值來評價基質效應，結果為負值表現為基質抑制，反之，則表現為基質增強［15］。結果表明，大部分磺胺類藥物表現為弱抑制基質效應，而磺胺吡啶和磺胺嘧啶的基質效應抑制較大，見表2。為了保證方法的準確性，在最佳實驗條件下，制備空白基質匹配標準曲線以減少基質效應影響，圖2 為空白基質中的23 種磺胺類藥物的總離子流圖。

表2 23種磺胺類藥物的基質效應、相關系數、檢出限、定量限、回收率與精密度

表2 （續）

23 種磺胺類藥物在1.0～50 ng/mL 的線性范圍內均有良好的線性關系，同時在空白樣品中添加低水平23 種藥物，分別以3 倍和10 倍信噪比對應的濃度來確定檢出限和定量限。23 種磺胺類藥物的檢出限均≤0.58 μg/kg，定量限均≤1.91 μg/kg。

取50 ng/mL 的23 種磺胺類藥物混合標準溶液進行精密度實驗，進樣6 次，比較定量離子峰面積，統計各種目標物峰面積，峰面積的RSD 為0.42%～5.2%。在空白樣品中進行3 個水平（1.0、5.0和10 μg/kg）的加標回收實驗，23 種藥物平均加標回收率為74.8%～106.0%，RSD（n=6）為3.1%～9.8%。

2.4 實際樣品測定

采用本實驗方法對10 批次烏骨雞樣品進行監測，1 批次烏骨雞檢出磺胺甲氧嘧啶（0.96 μg/kg），但未超過國家限量標準（農業部235 公告），其余樣品均未檢出目標物。

3 結論

基于分散固相萃取技術，以酸化乙腈為提取劑，C18、PSA 和MCNTs 為混合凈化劑，結合超高效液相色譜-串聯質譜，建立了烏骨雞中23 種磺胺類藥物殘留的分析方法。本方法操作簡便、快速、高效，靈敏度高且成本低廉，通過方法學驗證，準確性、重復性、檢出限和定量限均能滿足烏骨雞中的23 種磺胺類藥物殘留分析要求。為烏骨雞中藥物殘留監控提供技術支持，對進一步保障烏骨白鳳丸藥業質量安全具有現實意義。