呂李飛，魏孝欽，童麗，趙成周，徐衛(wèi)松，李忠寬，賈守寧，祁永福

1.青海大學(xué)，青海省糖脂代謝疾病防控中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)藏醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；3.華大基因，廣東 深圳 518083；4.青海省中醫(yī)院，青海 西寧 810012

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一種復(fù)雜的臨床綜合征，表現(xiàn)為神經(jīng)-內(nèi)分泌功能激活和外周血流分布異常，其發(fā)病率高、預(yù)后差，是多種心血管疾病如冠心病、高血壓等主要致死原因。中醫(yī)認(rèn)為，氣虛血瘀是心力衰竭形成的基本病機(jī)，氣虛日久伴有陽(yáng)虛，陽(yáng)少則內(nèi)寒生，內(nèi)寒又易招致外寒，使病情惡化。

代謝組學(xué)通過(guò)整合差異代謝物與疾病病理變化的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，能發(fā)現(xiàn)并闡明治療CHF的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有整體、動(dòng)態(tài)、全面的特點(diǎn)，不僅能系統(tǒng)、整體研究中醫(yī)證候，而且與中醫(yī)辨證觀不謀而合。因此可作為研究CHF氣虛血瘀證的切入點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)CHF氣虛血瘀證大鼠糞便代謝物進(jìn)行研究，初步探討CHF氣虛血瘀證的潛在生物標(biāo)志物，并進(jìn)行相關(guān)通路關(guān)聯(lián)分析，從代謝組學(xué)角度闡明CHF氣虛血瘀證的本質(zhì)，輔助CHF的中醫(yī)治療。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，6周齡，體質(zhì)量（200±20）g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（陜）2018-001。飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，使用許可證號(hào)SYXK（青）2020-0001，室溫23～25 ℃，光照/黑暗12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)青海省中醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（qhszyy1103201901）。

1.2 藥物與試劑

鹽酸異丙腎上腺素（貨號(hào)S31064），上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清（貨號(hào)G8001），武漢賽維爾生物科技有限公司；甲醇（貨號(hào)A454）、乙腈（貨號(hào)A998），美國(guó)賽默飛有限公司；甲酸（貨號(hào)50144），北京迪科馬科技有限公司；大鼠腦鈉肽（BNP）ELISA試劑盒（貨號(hào)E-EL-R0126c），武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

2777C液相色譜儀、Xevo G2-XS QTOF質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；Milli-Q純水儀，廣州東銳科技有限公司；ECLIPSE Ci-L 正置光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司；Pannoramic DESK 全景切片掃描儀，匈牙利3DHISTECH公司；ZS3 Exp型小動(dòng)物彩色多普勒超聲診斷儀，深圳邁瑞公司。

1.4 分組及造模

40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組10只、實(shí)驗(yàn)組30只。實(shí)驗(yàn)組采用皮下多點(diǎn)連續(xù)注射異丙腎上腺素10 mg/kg誘導(dǎo)CHF模型，連續(xù)14 d，每日稱量大鼠體質(zhì)量，調(diào)整給藥劑量。空白組注射等量生理鹽水。造模期間觀察并記錄大鼠一般情況。

給藥結(jié)束后次日對(duì)所有大鼠行超聲檢測(cè)，檢測(cè)前禁食水12 h，參考文獻(xiàn)[4-5]標(biāo)準(zhǔn)判斷CHF模型造模是否成功。基于“以方測(cè)證”理論及《基于中西醫(yī)臨床病癥特點(diǎn)的心力衰竭動(dòng)物模型分析》驗(yàn)證造模方法是否符合氣虛血瘀證動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)。剔除死亡及未成模的5只大鼠，從25只成模大鼠中隨機(jī)抽取10只作為模型組。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 超聲檢測(cè)

大鼠左胸部脫毛處理，異氟烷吸入麻醉，彩色多普勒超聲檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd），連續(xù)測(cè)量3 個(gè)心動(dòng)周期，計(jì)算左室短軸縮短率（LVFS）。LVFS（%）=（LVEDd－LVESd）÷LVEDd×100%。

1.5.2 血清腦鈉肽檢測(cè)

20%烏來(lái)糖腹腔注射（0.8 mL/100 g）麻醉大鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，腹主動(dòng)脈采血，常溫靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，取上層血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)BNP含量。

1.5.3 HE染色

取大鼠心肌組織，生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛溶液中固定，修剪，脫水，浸蠟，包埋，切片，行HE染色，封片，顯微鏡下觀察心肌組織病理改變。

1.5.4 糞便代謝組學(xué)檢測(cè)

將大鼠分別置于代謝籠中收集24 h 糞便，精密稱取25 mg糞便置于EP管中，加入800μL預(yù)冷的沉淀試劑（甲醇∶乙腈∶純水＝2∶2∶1），研磨機(jī)研磨（60 Hz，4 min），冰浴超聲（80 Hz，10 min），混合成勻漿。加入胎牛血清，封膜后震蕩搖勻，置于-20 ℃冰箱過(guò)夜。4 ℃、25 000×離心15 min，取600μL上清液再次離心，吸取上清液，冷凍抽干機(jī)抽干，加入600 μL 10%甲醇復(fù)溶，冰浴超聲（80 Hz，10 min），4 ℃、25 000×離心15 min，從空白組和模型組各樣品中取50 μL 混合，制成質(zhì)控（QC）樣品（總體積為1 mL），取60 μL上清液轉(zhuǎn)移至96孔微孔板，進(jìn)行封膜標(biāo)識(shí)、上機(jī)檢測(cè)。

液相色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為水-0.1%甲酸（A）、甲醇-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～2 min，100%A； 2～11 min， 100%～0%A； 11～13 min，0%A；13～15 min，0%～100%A）；柱溫50 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量5μL。

質(zhì)譜條件：采用高分辨質(zhì)譜對(duì)色譜柱洗脫下來(lái)的小分子物質(zhì)進(jìn)行正、負(fù)離子模式采集。正離子模式：毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓40.0 V；負(fù)離子模式：毛細(xì)管電壓2.0 kV，錐孔電壓40.0 V。MSE模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，一級(jí)掃描范圍50～1 200 Da，掃描時(shí)間0.2 s，以20～40 eV的能量對(duì)所有母離子進(jìn)行碎裂，采集所有碎片信息。在數(shù)據(jù)采集過(guò)程中，每3 s對(duì)LE信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正。同時(shí)，每隔10個(gè)樣品進(jìn)行一次QC樣品的采集。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Rawdata.tar 格式，利用Progenesis QI 2.2 進(jìn)行峰提取，獲取相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤30%的離子，QC-RSC法校正。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入metaX軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘-判別分析（PLS-DA），多變量選取PLS-DA模型變量投影重要性（VIP）≥1的主成分，結(jié)合單變量分析差異倍數(shù)（FC）≥1.2 或≤0.833 3 和q-value＜0.05，三者取交集得到差異代謝物。最后基于KEGG（https://www.kegg.jp/）、人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB，https://hmdb.ca）對(duì)代謝物進(jìn)行注釋。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)證型評(píng)價(jià)

模型組大鼠扎堆，活動(dòng)減少，體質(zhì)量減輕，食少，毛發(fā)凌亂、黃脆易掉，胞瞼下垂、無(wú)神呆滯，舌有瘀點(diǎn)，唇黯爪青，陰囊脫出，尿少，行超聲備皮前可見(jiàn)頸部青筋暴露，抓捕時(shí)易見(jiàn)甲掉出血，甚則全胸部觸之如石、滿胸積液。參照“1.4”項(xiàng)下評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示本研究模型大鼠與氣虛血瘀證相符。

2.2 心臟超聲結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS顯著降低（＜0.01），符合CHF大鼠造模評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較（，%）

2.3 模型大鼠血清腦鈉肽變化

與空白組比較，模型組大鼠血清BNP含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 2組大鼠血清BNP含量比較（，pg/mL）

2.4 模型大鼠心肌組織病理變化

空白組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)正常、分界清晰、排列規(guī)則，間質(zhì)未見(jiàn)明顯異常，無(wú)炎癥浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌組織可見(jiàn)大量纖維水腫，胞質(zhì)疏松淡染（黑色箭頭），組織邊緣可見(jiàn)心肌纖維溶解，被增生的結(jié)締組織取代（黃色箭頭），伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色箭頭）。見(jiàn)圖1。

圖1 2組大鼠心肌組織形態(tài)觀察（HE染色，×100）

2.5 多元統(tǒng)計(jì)分析

QC樣品總離子流圖（見(jiàn)圖2）重疊度高，表明本實(shí)驗(yàn)建立的分析方法穩(wěn)定，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。PCA主要用于觀察組間分離趨勢(shì)，反映組間和組內(nèi)的變異度。由圖3可知，與空白組比較，模型組大鼠糞便代謝物產(chǎn)生了一定變化；PLS-DA得分（見(jiàn)圖4）顯示，2組差異有顯著分離趨勢(shì)。使用metaX軟件建立模型組與空白組的PLS-DA模型，R和Q越接近1表明模型擬合越好。對(duì)R和Q進(jìn)行置換檢驗(yàn)（＝200），R＝0.95，Q截距＜0，表明本研究建立的模型有效，可用于CHF 氣虛血瘀證模型糞便差異代謝物的篩選。見(jiàn)圖5。

圖2 QC樣品總離子流圖

圖3 2組大鼠糞便代謝物PCA得分

圖4 2組大鼠糞便代謝物PLS-DA得分

圖5 2組大鼠糞便代謝物PLS-DA模型驗(yàn)證

2.6 差異代謝物篩選結(jié)果

按“1.6”項(xiàng)下篩選方法，將差異代謝物按VIP值大小排序，結(jié)合q-value及FC，共篩選出19種差異代謝物，主要包括3-磷酸肌醇、牛磺膽酸、二氫小檗堿、苯丙酮酸、月桂酸等（見(jiàn)表3），以log（FC）為橫坐標(biāo)、-lg（q-value）為縱坐標(biāo)繪制火山圖，見(jiàn)圖6。其中3-磷酸肌醇、二氫小檗堿、海藻氨酸、8-羥基腺嘌呤、羥基半乳糖等代謝物水平升高，牛磺膽酸、硒甲基硒代半胱氨酸、苯丙酮酸、月桂酸及槲皮素3-(6”-槐花苷)等代謝物水平降低。

圖6 CHF氣虛血瘀證大鼠糞便差異代謝物火山圖

表3 CHF氣虛血瘀證大鼠糞便潛在差異代謝物

采用R語(yǔ)言的pheatmap函數(shù)對(duì)篩選出的差異代謝物進(jìn)行聚類分析，得到差異代謝物熱圖（見(jiàn)圖7）。圖中每一行代表一個(gè)差異代謝物，每一列代表一個(gè)樣品，不同顏色表示強(qiáng)度，顏色從綠色到紅色表示強(qiáng)度由低到高。

圖7 CHF氣虛血瘀證大鼠糞便差異代謝物熱圖

2.7 差異代謝物分類和功能注釋

采用HMDB及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行分類和功能注釋，明確差異代謝物的相關(guān)代謝途徑及信號(hào)通路。本研究篩選出的差異代謝物主要包括氨基酸、嘌呤類、糖脂類及黃酮類等，主要代謝途徑涉及苯丙氨酸代謝、黃酮類代謝、能量代謝、糖脂代謝及膽汁酸代謝等，功能注釋主要涉及酪氨酸和色氨酸合成、膜轉(zhuǎn)位、信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等。見(jiàn)圖8。

圖8 CHF氣虛血瘀證大鼠糞便差異代謝物KEGG功能注釋

3 討論

異丙腎上腺素能加快大鼠心率，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，使其結(jié)構(gòu)紊亂，甚至肌纖維斷裂，進(jìn)而增加心肌耗氧量，加重心臟負(fù)荷，最終導(dǎo)致CHF。研究表明，在CHF長(zhǎng)期病理發(fā)展過(guò)程中，由于機(jī)體產(chǎn)能、供能不足導(dǎo)致內(nèi)源代謝物紊亂，而糞便代謝物是機(jī)體和腸道微生物協(xié)同代謝的結(jié)果，因此，基于CHF模型大鼠研究其糞便代謝組學(xué)不僅能在整體層面遴選疾病靶標(biāo)，而且可為中醫(yī)病證結(jié)合的現(xiàn)代化研究提供參考依據(jù)。

3-磷酸肌醇、類二十烷酸、葡萄糖醛酸苷是橋接能量和糖脂代謝的重要物質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca泵的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，受多靶點(diǎn)、多通路調(diào)控，但Ca濃度主要依賴3-磷酸肌醇的表達(dá)。3-磷酸肌醇作為重要信使，可通過(guò)cGMP/PKG通路誘導(dǎo)3-磷酸肌醇鈣通道開(kāi)放及結(jié)合受體活化，進(jìn)而刺激細(xì)胞膜引起Ca充電式內(nèi)流，使位于心肌的TPRV1處于選擇性抑制狀態(tài)，迫使降鈣素基因聚合物和P物質(zhì)感召抑制，打破心肌細(xì)胞受保護(hù)的模式。類二十烷酸是具有生物活性的脂質(zhì)分子，在CHF過(guò)程中發(fā)揮不確定性危害或保護(hù)作用，其在炎癥狀態(tài)下容易受嘌呤堿激活，并將激活信號(hào)呈遞給胞質(zhì)鈣依賴性PLA2，導(dǎo)致促炎性類二十烷酸及正十五烷酸、3-氧代十六烷酸、11Z二十八碳烯酸等可能參與促炎反應(yīng)的脂類表達(dá)升高，促炎性類二十烷酸在心血管疾病中發(fā)揮危害作用，不僅能加速心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體脂肪酸氧化，而且能合成內(nèi)源性TPRV1抑制物，參與細(xì)胞色素P450氧化。葡萄糖醛酸苷的苷鍵容易水解產(chǎn)生苷元，通過(guò)腸肝循環(huán)時(shí)被細(xì)胞色素P450氧化，引發(fā)糖脂代謝失調(diào)，最終造成DNA內(nèi)毒性損傷。上述3種代謝物水平在模型組大鼠糞便中顯著上調(diào)，一方面可能通過(guò)對(duì)Ca泵的調(diào)控，使葡萄糖氧化程度降低，心肌產(chǎn)能減少；另一方面通過(guò)促進(jìn)血栓素B2及脂氧素A4生成，誘導(dǎo)血小板聚集，降低脂質(zhì)和膽固醇的溶解性。心肌的能量代謝無(wú)法補(bǔ)給機(jī)體充足的ATP需求，同時(shí)高脂又使血小板內(nèi)的環(huán)氧酶轉(zhuǎn)移，花生四烯酸代謝受阻，從而轉(zhuǎn)向炎性通路代謝，加速CHF癥狀惡化。

此外，苯丙酮酸、月桂酸也是調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵物質(zhì)。苯丙酮酸是機(jī)體必需氨基酸苯丙氨酸的中間代謝產(chǎn)物，也是直接參與能量代謝的特征標(biāo)志物，其多途徑拓展細(xì)胞色素P450酶的激活，使月桂酸鏈內(nèi)羥基化，發(fā)揮高水平的康復(fù)調(diào)節(jié)作用，恢復(fù)葡萄糖有氧氧化功能，也能有效催化糖酵解，釋放更多能量，減輕機(jī)體在CHF狀態(tài)下缺氧和少能的活動(dòng)障礙。模型組大鼠糞便苯丙酮酸和月桂酸水平降低，提示CHF的能量代謝異常伴隨氨基酸代謝紊亂。

牛磺膽酸是膽汁酸和牛磺酸的結(jié)合物，廣泛參與脂類代謝，能增加膽固醇的溶解性，也能減輕海藻氨酸協(xié)同游離膽汁酸產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。因此牛磺膽酸的代謝障礙會(huì)引發(fā)膽汁酸水平紊亂。膽汁酸是腸-肝循環(huán)的關(guān)鍵物質(zhì)，可調(diào)節(jié)腸道內(nèi)脂質(zhì)代謝。同時(shí)牛磺膽酸可降低三羧酸循環(huán)（TCA）中檸檬酸的表達(dá)，引起TCA障礙，而TCA是糖類、脂類、氨基酸類的最終代謝通路，也是糖脂代謝、能量代謝、氨基酸代謝紊亂的直接標(biāo)志。本次研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠糞便牛磺膽酸水平下降，表明模型大鼠出現(xiàn)脂質(zhì)堆積，心肌細(xì)胞能量利用率降低，進(jìn)而出現(xiàn)扎堆、活動(dòng)少，精神萎靡，甚則陰囊脫出等表現(xiàn)。

高脫氧膽酸能激活NLRP3炎性小體，使Caspase-1、白細(xì)胞介素-1β等內(nèi)源性炎癥因子高表達(dá)；扁桃酸能促進(jìn)增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)，與炎性因子的活躍程度呈正相關(guān)；8-羥基腺嘌呤最終代謝生成尿酸，尿酸容易在血管壁沉積，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞；二氫小檗堿易誘發(fā)心臟毒性，導(dǎo)致獲得性長(zhǎng)QT綜合征；羥基半乳糖代謝異常可加速線粒體損傷。以上代謝物在模型組大鼠糞便中水平升高，提示模型大鼠出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷、炎癥因子侵噬、心肌能量生成障礙等表現(xiàn)。

既往研究表明，CHF能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca平衡被打破，進(jìn)而損傷心肌并造成心室肥厚，伴隨代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡。本研究篩選出的差異代謝物槲皮素3-(6”-槐花苷)屬黃酮類，能緩解蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)的心肌Ca超載損傷，其作用機(jī)制可能與鐵螯合相關(guān)。硒甲基硒代半胱氨酸具有抗氧化、抑制凋亡因子作用，能有效保護(hù)心血管，有希望成為候選治療藥物。5-羥基吲哚乙酸與膜電位的超極化密切相關(guān)，通過(guò)cAMP介導(dǎo)的色氨酸代謝能關(guān)聯(lián)CHF的預(yù)后。蘭尼堿可依賴位于心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)上的受體調(diào)控鈣循環(huán)，其受體的激活與cAMP、蛋白激酶Ⅱ相關(guān)。上述3種代謝物水平在模型組大鼠糞便中下調(diào)，表明在黃酮代謝受干擾的情況下，CHF會(huì)引起多元代謝物紊亂，這種病理機(jī)制可能與鈣循環(huán)有關(guān)，其具體機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究通過(guò)LC-MS技術(shù)篩選出19種CHF氣虛血瘀證的潛在差異代謝物，包括氨基酸、嘌呤類、糖脂類及黃酮類等成分，涉及苯丙氨酸代謝、黃酮類代謝、能量代謝、糖脂代謝及膽汁酸代謝等途徑，從代謝組學(xué)角度初步揭示了CHF氣虛血瘀證發(fā)病機(jī)理。基于本研究結(jié)果，后續(xù)將采用多組學(xué)技術(shù)相結(jié)合的模式進(jìn)一步研究該病證的生物學(xué)基礎(chǔ)，旨在為臨床CHF的療效評(píng)估及中醫(yī)診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。