miR-92b-3p靶向GDF11調控骨髓間充質干細胞*

牟朋林 麥彩園 王 斌

1 廣州新海醫院，廣東省廣州市 510080； 2 廣東省婦幼保健院； 3 佛山市三水區人民醫院

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種代謝性疾病，臨床特征為骨量及質量、骨強度下降為主[1]。我國50歲以上女性患病率超過了20%[2]。成骨細胞(Osteoblast，OB)和破骨細胞(Osteoclast，OC)調節代謝失衡，影響鈣質吸收利用，導致骨量減少、骨骼破壞，引起疼痛、骨折等問題[3]。miRNA是一種非編碼RNA，在腫瘤、骨與代謝等多個領域被研究[4]。近年來，miRNA在BMSCs和成骨中關注越來越多。研究表明miR-92b-3p可促進成骨分化[5]。生長分化因子GDF11(Growth differentiation factor 11)是屬于轉錄生長因子TGF-β超家族的一名成員。已知的TGF家族成員參與調控骨改建過程，如TGF-β促進破骨形成、抑制成骨分化[6]。而GDF11是否可以作為miR-92b-3p的靶點對BMSCs作用還不清楚。本文探討miR-92b-3p靶向GDF11對BMSCs調節成骨的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究方案按照1964年赫爾辛斯基宣言規定，由新海醫院的動物試驗倫理委員會審查通過。本研究選擇從廣州賽業生物科技有限公司購買糖尿病骨質疏松大鼠模型-SPF wistar大鼠10只。大鼠被處死，收集股骨近端1/3處的骨髓腔組織。

1.2 儀器與試劑 實時PCR儀、流式細胞儀：Progmega公司，美國。熒光素酶報告檢測系統：Bio-Rad公司，美國。RNA提取試劑盒：Takara鐸洋生物有限公司，中國。ALP、茜素紅染色試劑盒、載體：Takara公司，中國。DMEM培養基、成骨分化培養液：Bio-Rad公司，美國。胎牛血清、質粒、Lipofectamine 2000、293Tcell：Invitrogen公司，美國。質粒抽提試劑盒：Sigma公司，美國。模擬物及抑制物、RNAiMAX、Trizol試劑：QIAGEN公司，德國。

1.3 實驗方法

1.3.1 BMSCs細胞培養：從髓腔抽取骨髓4ml，建立BMSCs的體外培養體系，予以成骨分化：將骨髓與DMEM培養液混合。室溫離心，去上清。重懸細胞，將懸液緩慢注入Percoll分離液，離心，吸取中間細胞層，加入培養基，吹打獲得含有BMSCs細胞的懸液。于培養箱進行培養，換液，顯微鏡下觀察。胰酶消化，調節細胞濃度至2×105個/ml，繼續細胞培養板內培養。待細胞融合達到70%～80%，傳代培養。取第3代BMSCs，加入成骨誘導液誘導，提取RNA，進行qPCR。

1.3.2 qPCR：取樣品，移至RNAiso Plus液EP管，混合，加入氯仿，混合離心。上層加異丙醇，然后離心。移去上清，加入乙醇。離心棄去上清，加入無RNA酶水，讀取OD值。參照反轉錄試劑盒反轉錄將RNA合成cDNA。按以下條件擴增：95℃20s，95℃1s，60℃20s，40cycles。計算所有樣品的Ct值，以2-ΔΔCt表示相對表達量。

1.3.3 堿性磷酸酶(ALP)染色：根據ALP程序說明，測試ALP活性。收集BMSCs并裂解。離心，收集上清液，然后用對硝基苯磷酸酯孵育。酶標儀測OD值。

1.3.4 茜素紅染色：將PMOP細胞用PBS洗滌，多聚甲醛固定，茜素紅溶液染色。蒸餾水洗后行細胞照相。檢測細胞鈣沉積，以此反應成骨細胞鈣化。

1.3.5 細胞轉染：購買miR-92b-3p模擬物(mimics)和相應的陰性對照(NC group)、miR-92b-3p 抑制物(inhibitor)和對照(NC)。細胞鋪于孔板中，融合，吸出培養液，PBS緩沖液沖洗，更換養液，用Opti-MEM培養液將質粒分別稀釋，取對應組的RNA加入于轉染試劑中，孵育加入培養液中，培養后換普通培養液，繼續培養行表達量驗證。miR-92b-3p過表達48h后換成骨誘導培養基行成骨誘導培養。在誘導的7、14、21d 分別檢測ALP和茜素紅染色。共分為四組：BMSC組、BMSC+成骨分化液組、BMSC+過表達miR-92b-3p對照組、BMSC+過表達miR-92b-3p組。誘導第7天用qPCR檢測各組BMSCs成骨特異性因子Runx2及靶基因GDF11的表達。

1.3.6 雙重熒光素酶報告基因檢測：利用targetscan網站預測，miR-92b-3p可能結合的靶位點：GDF11。進行熒光素酶結合試驗，構建含miR-92b-3p結合位點的質粒命名為pMIR-GDF11-WT(野生型)、pMIR-GDF11-MT(突變型)。進行miR-92b-3p轉染，將細胞接種于24孔板中，并用Lipofectamine 2000將pMIR-GDF11-WT/pMIR-GDF11-MT載體與miR-92b-3p mimics共轉染至293T細胞。48h后用熒光素酶檢測。

2 結果

2.1 qPCR驗證miR-92b-3p過表達 將模擬物過表達轉染48h的細胞收集并提取RNA，后進行qPCR實驗示模擬物過表達轉染后細胞miR-92b-3p表達水平顯著上升：相對值由2.21±0.24上升至6.49±1.21(P<0.05)。

2.2 過表達miR-92b-3p后成骨能力升高 傳代細胞行miR-92b-3p過表達轉染，行ALP和茜素紅染色，過表達miR-92b-3p后隨著誘導時間增加，ALP水平逐漸上升，茜素紅染色結節沉積逐增加(圖1～2)。qPCR顯示Runx2表達：BMSC+成骨分化液組顯著上升，BMSC+過表達miR-92b-3p組顯著上升；GDF11的表達：BMSC+成骨分化液組顯著下降，BMSC+過表達miR-92b-3p組顯著下降(圖3)。

圖1 過表達miR后成骨 圖2 過表達miR后ALP

圖3 qPCR檢測Runx2和GDF11的表達

2.3 miR-92b-3p與GDF11結合位點驗證 使用targetscan網站找到miR-92b-3p與GDF11的結合靶點，如圖4所示。熒光素酶報告基因示miR-92b-3p可顯著抑制pMIR-GDF11-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-GDF11-MT活性(圖4～5)。

圖4 GDF11的mRNA與miR-92b-3p結合位點

圖5 熒光素酶報告實驗

3 討論

糖尿病性骨質疏松癥(Diabetic osteoporosis,DOP)是一種常見的由糖尿病引發的慢性代謝性骨病。發病率和病死率逐年升高的,迫切使臨床研究新的方法治療。本文研究[7]。BMSCs是一種“多能細胞”,可以分化為成骨、軟骨等細胞，研究表明在OP狀態時，BMSCs分化紊亂,成骨能力減低[8]。miRNA是一種非編碼單鏈RNA，大量存在于BMSCs內，影響各類細胞包括骨細胞的增殖[9-10]。miR-92b-3p通過靶向SGK3抑制C2C12細胞增殖并阻止C2C12細胞遷移[11]。白藜蘆醇通過增加miR-92b-3p的表達減弱NADPH氧化酶4 /核因子κB途徑，對雌激素缺乏癥引起的骨質疏松起保護作用[12]。近年來，在OP中miRNA調控BMSCs分化已成為熱點, miR-92b-3p可抑制DKKl進而促進在人臍帶間充質干細胞的成骨分化[5]。

GDF11可通過激活PI3K/Ak通路抑制糖尿病小鼠BMSCs凋亡[13]。既往研究表明，GDF11的缺失會引起骨骼相關的疾病:如GDF11敲除小鼠表現了骨骼相關疾病；抑制GDF11的功能會導致骨量的增加；GDF參與調控牙本質的分化并修復牙本質[6]。一些研究認為，GDF11能作為抗衰老因子，血清中的GDF11水平隨著年齡的增加而減少，GDF11能修復老年引起的大腦、骨骼肌及心肌干細胞的功能紊亂；然而，另一些研究得出完全相反的結論，認為血清中GDF11水平并不隨著年齡增加而增加，提高GDF11水平是老年相關疾病的危險因素，對小鼠全身用rGDF11處理抑制了骨骼肌的再生肌并不能修復老年相關的病理性心肌肥大[6]。這些相悖的研究結果，加上以往對于GDF11作為骨改建的調控因子的體內機制尚不明確，讓本研究更迫切去研究GDF11是否與骨量丟失有關。

本研究用qPCR法發現GDF11的表達在BMSC+成骨分化液組顯著下降，說明GDF11抑制成骨分化。qPCR法分析檢測miR-92b-3p在BMSCs誘導分化為OB的表達：過表達miR-92b-3p后BMSCs成骨能力顯著增強；過表達模擬物轉染后miR-92b-3p水平上升，證明miR-92b-3p促進成骨，參與OP的形成。

本研究合成了GDF11野生型和突變型序列。導入miR-92b-3p模擬物可與GDF11野生型結合，說明GDF11是miR-92b-3p的靶基因。成骨誘導第7天，Runx2表達：BMSC+成骨分化液組顯著上升，BMSC+過表達miR-92b-3p組顯著上升；GDF11的表達：BMSC+成骨分化液組顯著降低，BMSC+過表達miR-92b-3p組顯著降低。故進一步推論GDF11為miR-92b-3p的結合靶點。

本實驗不足之處如下，沒有進一步行Western blotting檢測miR-92b-3p的分化。本研究證實miR-92b-3p可通過GDF11因子作為靶點調節BMSCs分化參與OP的形成過程。為OP患者治療及研究提供了一定的依據。