基于網絡藥理學的北豆根治療潰瘍性結腸炎的作用機制

張科，宋崟，李波，谷冬梅，李正翔，袁恒杰

作者單位：天津醫科大學總醫院，a藥劑科，b檢驗科，天津 300052

潰瘍性結腸炎（ulcerative Colitis，UC）是一種病情復雜，病程較長，主要累及結腸的非特異性炎癥反應疾病，臨床很難根治［1］。目前治療以藥物治療為主，常用藥物包括氨基水楊酸類、糖皮質激素、免疫抑制劑等，但治療效果并不理想，且存在明顯的不良反應［2］。北豆根又名蝙蝠葛根，為防己科植物蝙蝠葛（Menispermum dauricum DC.）的干燥根莖［3］，其性寒味苦，有小毒，歸大腸、胃、肺經，具有祛風止痛和清熱解毒等功效，常用于咽喉腫痛、熱毒瀉痢、風濕痹痛等疾病的治療［4］。臨床很多含有北豆根的中藥方劑，對腸炎都有一定療效。相關試驗也證實：北豆根單味藥原液，可以通過降低IL-6、MMP 和VEGF 水平發揮對UC 模型大鼠的治療作用［2］；近年來，網絡藥理學發展迅速，該方法可以全面、系統對中藥多成分、多靶點作用機制進行闡釋［5］。本研究擬采用該方法探究北豆根治療UC 的作用機制，為其在臨床研究提供依據。

1 方法

1.1 北豆根化學成分與對應靶點的收集與篩選打開TCMSP 數據庫，以“北豆根”為關鍵詞檢索，收集藥材的化學成分。口服生物利用度（OB）是指藥物經血管外途徑給藥后吸收進入全身血液循環的相對量，其與藥物療效密切相關。藥物相似性（DL）指化合物與已知藥物的相似性，DL高的的化合物并不是藥物，但具有成為藥物的可能。研究顯示：藥物研發過程中OB 和DL 的好壞是決定目標分子是否篩選進入研究下一步的關鍵參數［6］。本研究以OB≥30%和DL≥0.18［7］為條件篩選有效成分；最后，收集數據庫中成分對應的靶點。打開Uniprot 數據庫，選擇UniprotKB ，輸入檢索式為“reviewed：yes AND organism：Homo sapiens（Human）”進行檢索，獲得20394 條人類的相關靶蛋白及對應基因的信息，以Excel 格式導出，再使用“VLOOKUP”函數進行匹配，將靶點轉換便于分析的標準基因名。

1.2 UC 治療靶點的篩選 打開Genecards 數據庫，以“ulcerative colitis”為關鍵詞檢索，收集UC 疾病靶點，以Excel 格式導出，然后將“1.1”節中北豆根的成分靶點的標準基因與疾病靶點基因取交集。

1.3 “藥物-有效成分-靶點”網絡的構建與分析 將藥物、有效成分和交集基因數據處理后，導入Cytoscape 3.2.1 軟件中繪制“藥物-有效成分-靶點”網絡圖，其中不同類型節點分別代表北豆根、有效成分和靶點，邊代表三者之間的關系。然后對網絡進行拓撲結構分析，再根據節點連接度（Degree）和介數中心性（Betweenness Centrality，BC）對網絡圖進行調整，節點的大小反映Degree 的大小，邊的粗細反映BC的大小［7］。

1.4 PPI 網絡的構建與核心靶點的篩選 將“1.2”節的交集基因導入STRING 數據庫繪制蛋白-蛋白互作網絡圖（protein-protein interaction，PPI），將分析數據以TSV 格式導出，導入Cytoscape3.2.1 軟件，繪制北豆根與UC 靶點的PPI 網絡圖，并對網絡進行拓撲結構分析；再利用“Generate style from statistics”工具對網絡節點的大小和顏色進行設置。網絡圖中節點的大小、顏色及其深淺變化代表Degree 值的大小，邊的粗細反映了Combine Score 的大小，從中篩選出Degree 值和接近中心度排名靠前的靶點作為核心靶點。

1.5 基因功能注釋分析和功能富集分析 將1.2節的交集基因導入DAVID 數據庫，并限定物種為人，進行基因功能注釋分析和功能富集分析，然后導出數據，對生物過程（P＜0.01）和信號通路（P＜0.05）進行篩選，并進行繪圖。

2 結果

2.1 北豆根有效成分及靶點的確定 檢索得到北豆根化學成分31 個，以OB≥30%和DL≥0.18 為條件篩選出有效成分10 個，包括蝙蝠葛堿、葉含去羥尖防己堿、蝙蝠葛辛堿、山豆根堿、山豆根波芬諾靈堿、漢防己堿、光千金藤堿、光千金藤定堿、北豆根堿、碎葉紫堇堿，具體信息見表1。檢索得到10個成分對應靶點175個：蝙蝠葛堿作用靶點2個，葉含去羥尖防己堿作用靶點2 個，蝙蝠葛辛堿作用靶點26個，山豆根波芬諾靈堿作用靶點24 個，漢防己堿作用靶點25 個，光千金藤堿作用靶點27 個，光千金藤定堿作用靶點30 個，北豆根堿作用靶點10 個，碎葉紫堇堿作用靶點29個，山豆根堿沒有對應靶點。將所得靶點蛋白名稱轉換為標準基因名，刪除重復和無效靶點，共獲取北豆根活性成分作用靶點78個。

表1 北豆根中10個有效成分的基本信息

2.2 UC 治療靶點的篩選結果 Genecards 數據庫檢索到UC 疾病靶點3982 個，將北豆根有效成分靶點和UC 疾病靶點取交集，得到交集基因44個，作為北豆根治療UC 的“關鍵靶點”，見圖1。

2.3 “藥物-有效成分-靶點”網絡分析結果“藥物-有效成分-靶點”網絡圖共包括55 個節點（1 個藥物節點，10 個活性成分節點、44 個靶點節點）和229 條邊，見圖2。對網絡圖進行拓撲分析顯示：蝙蝠葛辛堿、山豆根波芬諾靈堿、漢防己堿、光千金藤堿、光千金藤定堿、北豆根堿能與9個以上的靶點相連接，推測這6個成分是北豆根治療UC的主要有效成分。

2.4 PPI 網絡的分析 PPI 網絡包含43 個節點（其中HPSE 靶點與其他靶點沒有連接關系）和260 條邊，平均節點Degree 值為11.8。該網絡中度值（Degree）排名前10 的靶點包括：IL6、TNF、MYC、CASP3、MAPK14、PTGS2、NOS3、ESR1、RELA、MMP2。將PPI 網絡分析數據從STRING 數據庫中以TSV 格式導出，然后導入Cytoscape 3.2.1 軟件中，繪制北豆根與UC靶點的PPI 網絡圖，見圖3。

2.5 功能注釋分析和功能富集分析結果 北豆根治療UC 的“關鍵靶點”共在97 個（P＜0.01）GO term上富集，其中生物過程（BP）66 個，分子功能（CC）9個，細胞組成（MF）22 個。BP、CC、MF 的COUNT 得分排名前9 的分析結果如圖4 所示，主要涉及的生物學功能與過程包括：細胞增殖與凋亡調控、信號傳導、轉錄調控及藥物反應等；北豆根治療UC 的關鍵靶點共富集在62 條（P＜0.05）通路上，主要通過調控TNF、PI3K-Akt 、T 細胞受體等信號通路發揮作用，如圖5所示。

3 討論

本研究應用網絡藥理學方法對北豆根治療UC的物質基礎和作用機制進行研究。結果顯示：從北豆根31 個已知化學成分中共篩選獲得有效成分10個，北豆根和UC 的交集靶基因有44個，進一步探究了北豆根治療UC 的生物學過程、分子功能和細胞組成，發現涉及的生物過程包括：炎癥反應、免疫反應、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正向調控、轉錄的正向調節、細胞增殖正向調控、信號傳導以及藥物反應、細胞凋亡的負向調控、缺氧反應、NO 生物合成過程的正向調控等；分子功能包括：酶結合、蛋白結合、蛋白質同源二聚化活性、轉錄因子活性序列特異性DNA 結合、序列特異性DNA 結合、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子活性等，這些與UC 的發生和發展都有一定的聯系。

PPI 網絡分析結果顯示IL6、TNF、MYC、CASP3、MAPK14、PTGS2、NOS3、ESR1、RELA、MMP2 等靶點是網絡中的核心節點，推測它們是北豆根治療UC的關鍵靶點。現代研究表明IL-6 在UC 的發病過程中起著重要的作用，它的過度表達會使腸上皮細胞通透性增加，促進巨噬細胞和中性白細胞的分泌、增殖、溢出并浸潤至炎癥部位，誘發或加重UC［9-12］。KEGG 通路富集分析發現62 條通路與UC 的發病相關，主要包括：TNF 通路、PI3K-Akt 通路、T 細胞受體信號通路等。研究顯示：介導細胞的增殖、分化、凋亡和自噬的PI3K-Akt 信號通路［13］，活化后可上調腸黏膜p-Akt 表達［14］，激活核轉錄因子，上調TNF-α、IL-6等促炎因子的轉錄水平，誘發炎癥，導致組織損傷［15］，同時研究表明UC 相關的癌變與過度活化的PI3K-Akt信號通路有密切聯系［16-17］。

綜上，北豆根可能通過IL6、TNF、MYC、CASP3、MAPK14、PTGS2、NOS3、ESR1、RELA、MMP2 等靶點調控調控TNF 通路、PI3K-Akt 通路、T細胞受體信號通路等通路，進而對消化、免疫等系統進行干預，抑制UC 炎癥損傷。通過網絡藥理學的方法，不僅能有效闡明多成分中藥的藥理作用機制，還能揭示其作用靶點與關鍵信號通路，為中藥藥理和作用機制研究提供新的思路與方法，從而促進傳統中藥的應用。但是該方法也存在一定局限，其研究結論主要著眼于藥材中的已知成分、靶點和通路，而容易忽略了可能存在的未知成分和非核心靶點和通路的作用；雖能預測發揮作用的靶點，但無法獲知靶點的上調或下調，無法預測其功能改變的方向；同時也不能體現中藥體內代謝產物對機制的影響。因此，需要進一步的體內外試驗進行驗證網絡藥理學的預測的結果，才能更加準確、客觀地闡釋中藥的藥理作用機制。

（本文圖1～5見封三）