微小RNA-150靶向c-Myb表達對T淋巴細胞白血病Jurkat細胞增殖的影響

楊莉，劉煒，李彥格，管玉潔，毛彥娜

作者單位：鄭州兒童醫院、河南省兒童醫院、鄭州大學附屬兒童醫院血液腫瘤科，河南 鄭州 450000

T 淋巴細胞白血病（T lymphoblastic leukemia，TLL）是血液系統惡性腫瘤，來源于骨髓T 淋巴母細胞，發病率、病死率較高，具有淋巴結增大、白血病細胞浸潤、皮膚損害等特征，因常規治療易復發、化療療效差，長期生存率低，預后較差，而成為臨床治療的難題［1-3］。微小RNA（miRNA）作為基因表達調控的重要方式，是迄今為止研究較多的一類非編碼RNA，可調控靶基因廣泛參與血液系統疾病及其他腫瘤的進展過程［4-5］。有研究發現，miR-452、miR-139 等表達異常可導致T-LL 的發生并影響疾病進展［6-7］。近年來有文獻報道，miR-150 在慢性髓系白血病中表達下調，過表達miR-150 后可通過調節c-Myb 抑制人慢性髓系白血病細胞系K562 增殖［8］。然而，關于miR-150 靶向c-Myb 表達影響Jurkat 細胞增殖的報道較少。本研究自2020 年1—6 月研究miR-150 對人T-LL 細胞株Jurkat 中c-Myb 表達及細胞增殖、凋亡的影響，以期解釋miR-150 在T-LL 中的功能及分子機制，為發展以miRNA為靶點的T-LL治療新方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人T-LL 細胞株Jurkat 細胞（WD100074，美國ATCC 細胞庫）；Lipofectamine2000（11668-027，美國Invitrogen）；實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒（：K1002S，美國Promega）；人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）試劑（CK-04，日本同仁）；AnnexinVFITC/PI（S0185，哈爾濱新海基因）；c-Myb 抗體（ab117635）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（ab92552）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（ab32503）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（ab181602），美國abcam；羊抗兔（0295G-HRP，美國Santa）；ABI 7500 熒光定量PCR 儀，美國Applied Biosystems；BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀，美國BD；MODEL550 酶標儀、ChemiDocXRS 化學發光成像系統，美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 Jurkat 細胞用DMEM 培養基于培養箱（37 ℃、5%二氧化碳）中培養，融合80%傳代培養。

將Jurkat 細胞，分為空白對照組、陰性對照組及miR-150 過表達組，空白對照組Jurka 細胞不進行轉染處理，使用Lipofectamine 2000，向陰性對照組、miR-150 過表達組Jurka 細胞分別轉染negative control-miR-150、hsa-miR-150 mimic（序列由上海生工合成）。

1.2.2 qRT-PCR 法檢測各組Jurkat 細胞中miR-150、c-Myb 表達情況 將Jurkat 細胞按照“1.2.1”分組處理6 h，重懸于DMEM培養基中，按照1×104個/孔鋪于96孔培養板中，培養48 h，收集細胞，經總RNA提取、cDNA 合成后，qRT-PCR 法檢測miR-150（內參U6）、c-Myb（內參GAPDH）水平。設置PCR 儀程序為95 ℃10 min；40 次循環：93 ℃10 s，55 ℃25 s，72 ℃ 2 min；72 ℃ 10 min。 miR-150（F）：5'-AGAGTCTCCCAACCCTTGTA-3'，miR-150（R）：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；c-Myb（F）：5'-GCTGCTATGGTCTTAGCCTGTAG-3'，c-Myb（R）：5'-ACATCAACAACACACATCTCC-3'；U6（F）：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，（R） ：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；GAPDH（F）：5'-GACCCCTTCATTGACCTCAA-3'，GAPDH（R）：5'-TGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'，引物由上海生工合成。2-ΔΔCt法定量。

1.2.3 CCK-8 法檢測Jurkat 細胞增殖 將Jurkat 細胞按照“1.2.1”分組處理6 h，重懸于DMEM 培養基中，按照1×104個/孔鋪于培養板（96 孔），48 h 后加CCK-8，2 h后使用酶標儀（450 nm）檢測光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式細胞儀檢測Jurkat 細胞凋亡 將Jurkat細胞按照“1.2.1”分組處理6 h，重懸于DMEM 培養基中，按照1×104個/孔鋪于培養板（96孔），48 h后收集、消化、洗滌，調整成1×106個/毫升的細胞懸浮液，加入Annexin V-FITC、PI 各5 μL，1 h 避光孵育后使用流式細胞儀檢測。

1.2.5 熒光素酶實驗檢測miR-150與c-Myb的靶向關系 生物信息學軟件Targetscan 預測miR-150 和c-Myb mRNA 3'UTR 可能存在的結合位點。將與miR-150 互補結合的c-Myb 基因的3'UTR 序列片段插入到pGL3-basic構建3'UTR 質粒，將空載質粒（空載質粒組）和3'UTR 質粒（3'UTR 質粒組）分別與miR-150模擬物共轉染Jurkat細胞。轉染36 h后，檢測細胞相對熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測各組Jurkat 細胞中c-Myb、PCNA、Bax 蛋白表達情況 將Jurkat細胞按照1.2.1分組處理6 h，重懸于DMEM 培養基中，按照1×104個/孔鋪于96孔培養板中，48 h后收集、洗滌、裂解、冰浴、離心，收集上清并進行蛋白定量。取等量蛋白經電泳、轉PDVF 膜上、TBST 緩沖液（含5%脫脂奶粉）室溫封閉，1 h 后分別加入c-Myb 抗體（1∶1 000 稀釋）、PCNA 抗體（1∶1 000 稀釋）、Bax 抗體（1∶1 000 稀釋）和GAPDH 抗體（1∶1 000 稀釋），孵育過夜，加入1∶5 000 稀釋的羊抗兔二抗，孵育1 h，加入ECL試劑進行顯影和曝光，分析條帶灰度，以內參蛋白灰度定量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0 處理數據。數據均用±s 表示，行單因素方差分析，采用SNK-q 檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組Jurkat 細胞中miR-150、c-Myb mRNA表達情況 Jurkat 細胞中miR-150、c-Myb mRNA 水平在空白對照組與陰性對照組間差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白對照組相比，miR-150 過表達組Jurkat 細胞中miR-150 水平升高（P＜0.05），c-Myb mRNA水平降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組Jurkat細胞中miR-150、c-Myb mRNA表達水平比較/±s

表1 各組Jurkat細胞中miR-150、c-Myb mRNA表達水平比較/±s

注：①較空白對照組，P＜0.05。②較陰性對照組，P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-150過表達組F值P值c-Myb mRNA 0.98±0.09 1.01±0.05 0.66±0.14①②22.43＜0.001重復次數666 miR-150 1.03±0.09 1.02±0.05 1.42±0.14①②31.01＜0.001

2.2 各組Jurkat細胞增殖、凋亡情況比較 空白對照組與陰性對照組Jurkat 細胞OD 值及凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組相比，miR-150 過表達組Jurkat 細胞OD 值顯著降低，凋亡率顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組Jurkat細胞的OD值及凋亡率比較/±s

表2 各組Jurkat細胞的OD值及凋亡率比較/±s

注：①較空白對照組，P＜0.05。②較陰性對照組，P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-150過表達組F值P值凋亡率/%8.76±0.74 9.13±0.88 20.79±1.15①②318.56＜0.001重復次數666 OD值0.46±0.09 0.49±0.08 0.25±0.06①②17.01＜0.001

2.3 miR-150 與c-Myb 的靶向關系 Targetscan 生物信息學軟件預測顯示，miR-150 和c-Myb mRNA 3'UTR存在結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，與空載質粒組相比，3'UTR 質粒組Jurkat 細胞相對熒光素酶活性顯著降低［（0.68±0.16）比（1.01±0.11），t=4.16，P=0.002］。

2.4 各組Jurkat細胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白表達情況 空白對照組與陰性對照組Jurkat 細胞中c-Myb、PCNA、Bax 蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組相比，miR-150 過表達組Jurkat細胞中c-Myb、PCNA 蛋白水平降低（P＜0.05），Bax 蛋白水平升高（P＜0.05），見圖1，表3。

表3 各組Jurkat細胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白水平比較/±s

表3 各組Jurkat細胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白水平比較/±s

注：GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，PCNA為增殖細胞核抗原，Bax為Bcl-2相關X蛋白。①較空白對照組，P＜0.05。②較陰性對照組，P＜0.05。

組別空白對照組陰性對照組miR-150過表達組F值P值重復次數Bax/GAPDH 0.42±0.13 0.46±0.14 0.65±0.18①②3.72 0.042 666 c-Myb/GAPDH 0.64±0.12 0.73±0.13 0.37±0.06①②18.10＜0.001 PCNA/GAPDH 0.56±0.11 0.59±0.13 0.33±0.07①②10.74 0.001

圖1 各組Jurkat細胞中c-Myb、PCNA、Bax蛋白表達

3 討論

miRNAs 是一類進化中高度保守，分布廣泛，長度為21～24 個核苷酸的非編碼RNA，通過作用于靶基因，使靶基因轉錄受到抑制或mRNA 降解，從而負調控靶基因表達。近年來，對miRNA 的深入研究發現，miRNA 基因的突變或表達失調與多種癌癥關系密切，可以通過發揮抑癌或促癌功能，參與癌癥的發生發展，有望成為癌癥的治療靶點［9-10］。miR-150是研究較多的miRNAs 之一，其在多種實體腫瘤中均異常表達，可用于預測腫瘤發生發展及進行預后評估［11-12］。李均等［13］研究表明，miR-150在宮頸癌組織中高表達，可能作為癌基因調控宮頸癌的發生及發展。杜曉陽等［14］研究表明，過表達miR-150 能夠抑制結直腸癌細胞的侵襲與轉移能力，進而抑制腫瘤的生長與轉移。因此，miR-150 在腫瘤中的調控具有多樣性，可能發揮抑癌或促癌功能。王瑩等［15］通過構建慢病毒載體過表達miR-150，發現過表達has-miR-150 可能通過負調控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB（phosphoinositide-3-kinase/serine threonine kinase/nucler factor κB，PI3K/Akt/NFκB）信號通路，抑制Jurkat 細胞增殖并誘導其凋亡。本研究結果顯示，過表達miR-150后，Jurkat細胞OD值顯著降低，凋亡率顯著升高，提示miR-150在T-LL進展中起抑癌基因作用，這與王瑩研究一致，但具體機制尚不清楚。

T-LL 的發生過程是原癌、抑癌基因間作用失衡的后果結果，其中，癌基因c-Myc 起重要作用，可通過細胞自噬機制、非細胞自噬機制誘導急性T-LL 表現出明顯的原癌基因成癮性，因此，針對c-Myc 基因進行治療可能成為治療急性T-LL 的突破方向［16］。呂國慶等［17］研究表明，c-Myc 抑制劑CPI-203 可明顯抑制急性T 淋巴細胞白血病Jurkat 細胞增殖。但c-Myc 缺乏明確的配體結合域，特異性阻斷c-Myc 基因激活十分困難，研究靶向抑制c-Myc 基因激活的方法具有重要意義［18］。周小翠等［19］研究表明，miR-150通過靶基因c-Myb改善心肌梗死后心肌纖維化。陳連香等［8］研究表明，miR-150 下調靶基因c-Myb 的表達抑制慢性髓系白血病細胞的增殖。何旭等［20］研究發現，T-LL病兒血漿miR-150水平降低，其水平檢測對T-LL 診斷、病情判斷和預后評估具有一定作用。本研究結果顯示，過表達miR-150 后，Jurkat 細胞中c-Myc mRNA 和蛋白水平均顯著降低，提示miR-150 在Jurkat 細胞中可以阻斷c-Myc 基因激活，且雙熒光素酶報告基因實驗結果證實，miR-150 在Jurkat細胞中可以靶向調控c-Myc基因。

PCNA 是增殖相關基因，在腫瘤增殖過程中發揮作用［21］。Bax 是B 淋巴細胞瘤-2 蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族的促凋亡成員，可促進細胞凋亡［22］。本研究發現，過表達miR-150 后，Jurkat 細胞中PCNA 蛋白水平顯著降低，Bax 蛋白水平顯著升高，提示miR-150 靶向阻斷c-Myc 基因激活后，通過下調PCNA 表達、上調Bax 表達抑制Jurkat 細胞增殖并促進其凋亡。

綜上所述，miR-150 可能靶向c-Myb 表達，進而通過影響PCNA、Bax 表達抑制Jurkat 細胞增殖并誘導其凋亡，這可能為靶向治療T-LL 提供了一定參考。