微小RNA-146a靶向調(diào)控Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子7對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎T細(xì)胞炎癥反應(yīng)及自噬的影響

李家江，王守鵬，張兆川，趙騰

作者單位：棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院骨科，山東 棗莊 277100

強(qiáng)直性脊柱炎是臨床常見的一種炎癥性疾病，免疫炎癥、細(xì)胞自噬等均可能參與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明細(xì)胞炎癥因子可參與自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生及發(fā)展過程［1-2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種非編碼單鏈RNA 分子，并可通過堿基互補(bǔ)與靶基因結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，研究表明miRNA 在強(qiáng)直性脊柱炎病人T細(xì)胞中表達(dá)異常并可能參與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)生及發(fā)展過程［3-4］。因而探究miRNA 在強(qiáng)直性脊柱炎病人T細(xì)胞炎癥反應(yīng)及自噬中的作用具有重要意義。研究表明強(qiáng)直性脊柱炎病人外周血中微小RNA-146a（microRNA-146a，miR-146a）表達(dá)上調(diào)，但關(guān)于其在強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚未可知［5］。通過生物信息學(xué)分析顯示Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子7（Krüppel-like factor，KLF7）可能是miR-146a 的靶基因，研究表明KLF7 可促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，并可在神經(jīng)損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［6］。因此，本研究主要探究miR-146a對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞炎癥反應(yīng)及自噬的影響，探討其對(duì)KLF7的靶向調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 收集棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院收治的強(qiáng)直性脊柱炎病人18 例為研究對(duì)象（2016 年2月至2017 年10 月），所有病人均符合強(qiáng)直性脊柱炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，其中男10例，女8例，年齡（28.67±6.32）歲。選取同期于棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院體檢的健康志愿者24 例為對(duì)照組，其中男14 例，女10 例，年齡（30.25±4.12）歲。兩組性別（χ2=0.03，P=0.857）、年齡（t=0.98，P=0.333）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抽取兩組研究對(duì)象的外周靜脈血10 mL，置于含有EDTA-二鉀抗凝試管中，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離收集外周血單核細(xì)胞，采用T 細(xì)胞磁珠分離T細(xì)胞。

所有病人知情且簽署同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆籐ipofectamine2000、Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；PCR 試劑盒購自大連寶生物公司；anti-miR-146a、anti-miR-NC、miR-146a mimics、miR-NC購自廣州銳博生物科技有限公司；白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-17、IL-23 檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗人KLF7 抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗人自噬相關(guān)基因5（ATG5）、Beclin-1 抗體購自美國Santa Cruz 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 強(qiáng)直性脊柱炎病人T細(xì)胞接種于96孔板（5×104個(gè)/孔），分別將anti-miR-NC、anti-miR-146a、pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF7 轉(zhuǎn)染至T 細(xì)胞，分別記作anti-miR-NC 組、anti-miR-146a 組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-KLF7組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)水平 采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒配置反應(yīng)體系。miR-146a以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146a 相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測IL-6、IL-17、IL-23的水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA 法檢測IL-6、IL-17、IL-23 的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-146a 的靶基因 starBase 預(yù)測顯示KLF7 的3’UTR 含有miR-146a的互補(bǔ)序列，分別構(gòu)建野生型載體WT-KLF7與突變型載體MUT-KLF7，分別將WT-KLF7、MUTKLF7 與miR-NC、miR-146a mimics 共轉(zhuǎn)染至T 細(xì)胞，檢測細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測KLF7、ATG5、Beclin-1 蛋白表達(dá) 收集各組強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，檢測蛋白濃度，SDSPAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入一抗稀釋液與孵育二抗稀釋液，室溫孵育1 h，應(yīng)用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s 表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a 在強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞中的表達(dá) 與健康人T 細(xì)胞比較，強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞中miR-146a 的表達(dá)量升高［（1.00±0.08 ）比（2.74±0.13），t=53.54，P＜0.001］。

2.2 抑制miR-146a 對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-146a 組IL-6、IL-17、IL-23 的水平降低（P＜0.001），見表1。

表1 抑制miR-146a對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者T細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響/±s

表1 抑制miR-146a對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者T細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響/±s

組別anti-miR-NC anti-miR-146a t值P值重復(fù)次數(shù)33 miR-146a 0.99±0.07 0.27±0.03 16.38 0.000 IL-6/（ng/L）823.17±14.10 372.31±11.03 43.62 0.000 IL-17/（ng/L）901.00±16.29 428.39±12.34 40.06 0.000 IL-23/（ng/L）886.38±15.11 401.61±11.75 43.87 0.000

2.3 抑制miR-146a 對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞自噬的影響 與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-146a 組ATG5、Beclin-1 蛋白水平升高（P＜0.001），見圖1，表2。

表2 抑制miR-146a對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者T細(xì)胞自噬的影響/±s

表2 抑制miR-146a對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者T細(xì)胞自噬的影響/±s

組別anti-miR-NC anti-miR-146a t值P值重復(fù)次數(shù)33 ATG5 0.33±0.03 0.79±0.07 10.46 0.000 Beclin-1 0.42±0.04 0.91±0.08 9.49 0.001

圖1 ATG5、Beclin-1蛋白的表達(dá)

2.4 miR-146a 靶向KLF7 starBase 預(yù)測顯示KLF7 的3’UTR 含有miR-146a 的互補(bǔ)序列，見圖2。miR-146a 過表達(dá)可降低WT-KLF7 的熒光素酶活性（P＜0.001），而對(duì)MUT-KLF7 的熒光素酶活性無明顯影響（P=0.775），見表3。與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-146a 組KLF7 蛋白水平升高［（0.89±0.07）比（0.37±0.04），t=11.17，P＜0.001］，見圖3。

圖2 KLF7的3’UTR含有miR-146a的互補(bǔ)序列

圖3 anti-miR-NC組與anti-miR-146a組Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子7蛋白表達(dá)

表3 miR-146a過表達(dá)對(duì)WT-KLF7及MUT-KLF7熒光素酶活性的影響/±s

表3 miR-146a過表達(dá)對(duì)WT-KLF7及MUT-KLF7熒光素酶活性的影響/±s

組別miR-NC miR-146a t值P值重復(fù)次數(shù)33 WT-KLF7 0.98±0.07 0.29±0.03 15.69 0.000 MUT-KLF7 0.97±0.08 0.99±0.08 0.31 0.775

2.5 過表達(dá)KLF7 對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞炎癥反應(yīng)及自噬的影響 與pcDNA3.1 組比較，pcDNA3.1-KLF7 組IL-6、IL-17、IL-23 的水平降低（P＜0.001），ATG5、Beclin-1 蛋白水平升高（P=0.002），見圖4，表4。

圖4 pcDNA3.1組與pcDNA3.1-KLF7組KLF7、ATG5、Beclin-1蛋白的表達(dá)

表4 過表達(dá)KLF7對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者T細(xì)胞炎癥反應(yīng)及自噬的影響/±s

表4 過表達(dá)KLF7對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者T細(xì)胞炎癥反應(yīng)及自噬的影響/±s

組別pcDNA3.1 pcDNA3.1-KLF7 t值P值重復(fù)次數(shù)33 KLF7 0.38±0.04 1.03±0.08 12.59 0.000 IL-6/（ng/L）823.17±14.10 477.37±12.01 32.34 0.000 IL-17/（ng/L）901.00±16.29 558.67±13.16 28.31 0.000 IL-23/（ng/L）886.38±15.11 531.69±12.75 31.07 0.000 ATG5 0.32±0.03 0.60±0.06 7.23 0.002 Beclin-1 0.44±0.04 0.78±0.07 7.30 0.002

3 討論

miRNA 可通過調(diào)控靶基因表達(dá)從而影響強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞凋亡及自噬等生物學(xué)過程，自噬引發(fā)的自身免疫耐受可預(yù)防自身免疫疾病的發(fā)生［8-10］。研究表明降低miR-146a 的表達(dá)量可延緩強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)展進(jìn)程［11］。相關(guān)報(bào)道指出miR-146a 可參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化、血小板免疫炎癥反應(yīng)等多種炎癥反應(yīng)過程［12-13］。本研究結(jié)果顯示強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞中miR-146a 的表達(dá)量升高，提示miR-146a 在強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。

促炎因子與抗炎因子比例失衡是促進(jìn)強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)生的重要原因之一，研究表明IL-6、IL-17、IL-23 水平升高可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生從而加重疾病進(jìn)展［14-15］。本研究結(jié)果顯示抑制miR-146a 表達(dá)后，強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-17、IL-23 水平降低，提示抑制miR-146a 表達(dá)可抑制強(qiáng)直性脊柱炎病人T細(xì)胞炎癥反應(yīng)。自噬異常與各種疾病發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，ATG5 與Beclin-1 屬于自噬的標(biāo)志物，其表達(dá)增強(qiáng)可作為評(píng)估自噬水平升高的標(biāo)志物［16］。本研究結(jié)果顯示抑制miR-146a 表達(dá)后強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞ATG5、Beclin-1 蛋白水平升高，說明miR-146a 可抑制強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞自噬水平。提示miR-146a 在強(qiáng)直性脊柱炎病人T細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測KLF7 可能是miR-146a 的靶基因，本研究證實(shí)miR-146a 可靶向結(jié)合KLF7。研究表明抑制KLF7 表達(dá)可促使視網(wǎng)膜功能、中樞神經(jīng)功能障礙的發(fā)生，還可參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生過程［17-19］。本研究結(jié)果顯示KLF7 過表達(dá)后，強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞IL-6、IL-17、IL-23 的水平降低，ATG5、Beclin-1蛋白水平升高，說明KLF7過表達(dá)可抑制強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。提示miR-146a 可能通過靶向KLF7 基因而參與炎癥反應(yīng)及自噬過程從而在強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)生過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述，強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞中miR-146a 表達(dá)上調(diào)，抑制miR-146a 表達(dá)可能通過上調(diào)KLF7 的表達(dá)從而抑制強(qiáng)直性脊柱炎病人T 細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生，可為強(qiáng)直性脊柱炎的診斷及治療提供新方向。