肺外結核80例臨床病理特征及幾種常見結核分枝桿菌檢測技術對比分析

趙潔婷，李會方，葉偉，宋蓉蓉，徐建平

作者單位：安徽省胸科醫院病理科，安徽 合肥 230022

結核分枝桿菌最常見的感染部位是肺，但也可影響其他部位，如淋巴結、骨骼和關節、泌尿生殖道和胸膜等，這類病例可被診斷為肺外結核（extrapulmonary TB，EPTB）［1］。與肺結核相比，人們對肺外結核關注不足，其相關研究也相對較少。由于肺外結核的臨床表現形式多樣，臨床上肺外結核病的診斷比較困難，時常被誤診或漏診。肺外結核病是一種可治性疾病，早期診斷和治療對改善其預后意義重大［2］。本研究對80 例肺外結核病人的臨床病理資料進行分析，探究其臨床病理特征及相關實驗室檢查在疾病確診過程中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年8 月至2019 年8 月間就診于安徽省胸科醫院并經組織病理學診斷的80例肺外結核病人的臨床病理資料，男性41 例，女性39 例。年齡范圍為19～84 歲，年齡（47.91±16.78）歲，中位年齡49歲。

1.2 病理診斷 內鏡、穿刺活檢或手術切除組織，常規行10%的中性福爾馬林固定、石蠟包埋、連續切片及HE 染色。由三名高年資病理醫生雙盲法閱片，按照《中國結核病病理學診斷專家共識》［3］推薦的結核病診斷流程，結合形態學改變、特殊染色及分子病理基因檢測作出診斷。

1.3 福爾馬林固定-石蠟包埋（FFPE）標本熒光PCR 技術檢測MTB-DNA 石蠟包埋組織厚5μm連續切片，活檢標本10 片，手術標本5 片，置于1.5 mL EP管中，嚴格按廈門艾德公司核酸提取試劑（閩夏械備20150082號）說明書進行核酸提取。使用紫外分光光度計對核酸濃度和純度進行測定，對核酸合格的樣品嚴格按結核分枝桿菌（TB）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書進行結核分枝桿菌DNA 的測定。結果分析：目標基因的CT 參考值為39，內標的CT 參考值為40。對于測定CT≤39 的樣本，報告為結核分枝桿菌DNA 陽性；對于測定CT＞39 的樣本，同時內標CT≤40，報告注明結核分枝桿菌DNA 低于試劑盒檢測下限，若內標CT＞40 或無顯示，該檢測無效。結核分枝桿菌（TB）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）購自北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司。

1.4 FFPE 標本抗酸染色 采用Ziehl-Neelsen 染色法，抗酸染色試劑（粵珠械備20170035號）購自珠海貝索生物技術有限公司。石蠟包埋組織4μm 連續切片，常規脫蠟至水，將切片周圍余液吸干。后續具體操作流程按試劑盒說明進行，常規設陽性對照。

1.5 FFPE標本分枝桿菌菌種鑒定 對已提取的待測樣品DNA 進行PCR 擴增、雜交、洗膜和顯色等步驟進行分枝桿菌菌種鑒定。具體操作嚴格按分支桿菌菌種鑒定基因檢測試劑盒（PCR-反向點雜交法）說明書（注冊號：國械注標20153400229）進行。試劑盒購自亞能生物技術（深圳）有限公司。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20. 0 軟件進行數據統計分析。計量資料采用±s 表示，計數資料以例（%）表示。組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義，將熒光PCR 組作為共用對照，其余各實驗組均與熒光PCR 組比較，而各實驗組間不須比較，采用χ2分割法，α'=α/2（k-1），α=0.05，k 為實驗組數。

2 結果

2.1 一般資料 80 例肺外結核中，年齡分布19～84 歲，年齡（47.91±16.78）歲，其中19～30 歲16 例（20.0%），31～40 歲12 例（15.0%），41～50 歲16 例（20.0%），51～60 歲15 例（18.8%），61～70 歲12 例（15.0%），71～84歲9例（11.2%）。

2.2 合并癥 分析80 例肺外結核病人的臨床資料發現，有合并癥者8 例（10.0%），其中合并糖尿病的1例，癌癥3例，腎移植1例，高血壓2例，腎功能不全1 例。合并肺結核的有45 例（56.3%），除30 例（66.7%）在就診前已明確有肺結核，其余15 例（33.3%）均是在肺外結核的診療過程中確診。

2.3 肺外結核的組成及臨床表現 肺外結核可發生于全身多器官、組織，以淋巴結結核多見。多數病人的首發癥狀以系統局部癥狀為主，結核全身中毒癥狀少見。肺外結核的部位及臨床表現見表1。

表1 肺外結核80例組成及臨床表現

2.4 肺外結核的病理特征 肺外結核的病理變化與肺結核一致，基本病理變化主要為滲出性、增生性（包括壞死性肉芽腫和非壞死性肉芽腫）和壞死性病變，這3種病理變化常混雜存在，往往以某一種改變為主，并且隨著機體抵抗力、對MTB 變態反應的強度、MTB 菌量及毒力強度的不同而相互轉化。在本研究中，淋巴結結核病理改變以壞死性肉芽腫常見（72.7%）；鼻、咽、喉、聲帶、聲門結核病理改變以滲出性病變常見（54.6%）；骨、關節結核病理改變以壞死性肉芽腫常見（44.4%）；泌尿、生殖系統結核病理改變以壞死性肉芽腫常見（50.0%），消化道結核病理改變以壞死性肉芽腫常見（50.0%），腹膜結核及皮膚結核病理改變均以壞死性肉芽腫常見（100%）。不同部位的結核，其病理改變見表2。

表2 肺外結核80例的病理改變/例（%）

2.5 常見結核分枝桿菌檢測技術比較 回顧性分析病人的相關實驗室檢查結果，對不同結核分枝桿菌檢測技術的陽性率進行比較。結果發現FFPE 標本結核分枝桿菌熒光PCR 檢測的陽性率高于菌種鑒定結核分枝桿菌復合群MTC（χ2=19.88，P＜0.001）、高于血液檢測結核感染T 細胞斑點試驗TSPOT（χ2=16.65，P＜0.001）和血清學結核抗體檢測（χ2=47.21，P＜0.001），FFPE 標本結核分枝桿菌熒光PCR 的陽性率與抗酸染色陽性率的差異無統計學意義（χ2=5.74，P=0.017）。見表3。

表3 肺外結核80例相關實驗室檢查

肺外結核占全部結核病的比例約10%～20%［4］。肺外結核病死亡人數占結核病全部死亡人數的9.8%［5］。之前的一些研究已經證實了肺外結核患病與年齡相關，主要原因是年齡越大抵抗力越差，患病的風險越高［6-9］。本研究未見小于19歲的青少年發病，真正原因尚不清楚，有學者認為可能原因為：在中國，為預防兒童結核病普遍進行新生兒卡介苗接種，從而限制了結核桿菌在體內的傳播［10］。然而，這種干預并不能對結核分枝桿菌感染產生長期免疫［11］。同時，我們的研究提示，患病人群主要集中在20～60 歲，這可能與機體的免疫動態變化有關，也可能還涉及生活習慣和社會因素［12］。無論如何，我們的發現對于實現不同年齡病人的肺外結核的預防和控制有著重要的意義，提醒醫生要警惕肺外結核的發生，以防止漏診或延誤診斷。

已知的研究結果顯示，結核病的危險因素（糖尿病、免疫抑制劑的使用、肺癌、營養不良等）在肺結核和肺外結核中均可見［13-14］。本研究結果顯示，在80 肺外結核中，伴有糖尿病的1 例、癌癥3 例、長期服用免疫抑制藥物的1 例、高血壓2 例，腎功能不全者1 例，此結果提示肺外結核在免疫功能正常的人群中的發生情況不容小覷。有些未得到控制的肺結核，結核分枝桿菌入血，通過血行播散至其他臟器，導致肺外結核。肺外結核也可引起繼發性肺結核［15］。本研究發現80 肺外結核病人中，45 例（56.3%）伴有肺結核。除30例在就診前已明確有肺結核，其余15 例均是在肺外結核的診療過程中確診。

肺外結核可影響多器官或組織，其中以淋巴結和胸膜最為常見。淋巴結結核約占肺外結核的30%～50%，最常見的部位是頸部、下頜下或鎖骨下的淋巴結，胸內和腹腔內淋巴結感染較少［16］。在本研究中，淋巴結結核的發生率約為55%。此結果和王謙信、陳水芳［17］的研究結果相符。同時，本研究結果顯示，鼻、咽、喉、聲帶、聲門是繼淋巴結之后，肺外結核較常感染的部位（13.8%），然而，一項有關中國肺外結核多中心觀察性研究提示，鼻、咽、喉、聲帶、聲門結核的比例僅1.1%［1］。我們發現骨、關節是肺外結核的比例約11.2%，該比例略高于上述中國肺外結核多中心觀察性研究的結果6.4%［1］。泌尿生殖系統結核在我們的研究中也有出現，比例約10%，其在上述多中心觀察性研究結果的比例為2.1%［1］。這些差異表明，肺外結核流行病學的動態可能與地理位置和人口有關，需要在不同的地理區域進行更多以人口為基礎的研究。本研究結果顯示消化道結核的比例為5.0%，腹膜結核及皮膚結核的比例均為2.5%，該結果與上述多中心研究的結果基本一致（消化道結核4.8%，腹膜結核及皮膚結核均為2.2%）。

因肺外結核可累及多系統、多部位、多臟器，這就決定了其臨床表現的多樣性、非特異性及隱匿性［18-19］。部分病人病程中可無發熱和其他結核中毒癥狀，多以局部表現為主，如局部淋巴結的腫大或膿腫的形成。鼻、咽、喉、聲帶、聲門部位的結核癥狀以局部表現為主，如異物感、聲音嘶啞等。骨、關節結核癥狀主要為病變部位的疼痛或壓痛。泌尿、生殖系統結核在我們的研究中也有出現，病人就診的主要原因為局部的包塊，檢查提示盆腔、鞘膜腔少量積液等。消化道及腹膜結核往往表現為腹脹、腹痛、腹瀉、惡心嘔吐乏力，盆、腹腔積液等。皮膚結核主要表現為局部包塊。尤其在疾病早期，肺外結核可與多種疾病的表現相類，僅憑體檢和無創性檢查無法診斷，極易造成誤診或漏診，需憑借手術或穿刺等有創手段獲取組織標本，參考病理組織學改變做出診斷。

肺外結核的病理變化與肺結核一致，均包括滲出性、增生性和壞死性三種病變［3］。滲出性病理改變主要為局部組織小血管擴張、充血，伴中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，可見炎性滲出及纖維素樣壞死。增生性病變以壞死性肉芽腫和非壞死性肉芽腫多見。當菌量多、毒力強、機體抵抗力低下或變態反應強烈時滲出性和增生性病變可出現以壞死為主的病理變化［3］。在本研究中，淋巴結結核的主要病理改變為壞死性肉芽腫（72.7%），其次為壞死性病變（19.2%），少數表現為非壞死性肉芽腫（9.1%）。鼻、咽、喉、聲帶、聲門結核的主要病理改變為滲出性病變（54.6%），其次為壞死性肉芽腫（36.4%），少數表現為壞死性病變（9.1%）。骨、關節結核主要病理改變為壞死性肉芽腫（44.4%），其次為壞死性病變（27.3%）和滲出性病變（22.3%）。泌尿、生殖系統結核主要病理改變為壞死性肉芽腫（50.0%），其次為非壞死性肉芽腫（25.0%）和壞死性病變（25.0%）。腹膜結核及皮膚結核的病理改變均表現為壞死性肉芽腫（100%）。結果提示結核分枝桿菌感染不同部位時，其主要病理改變存在差異。然而，無論哪一部位的肺外結核，基本都有肉芽腫病變，在影像上肉芽腫可有不同的表現，有些與腫瘤性疾病相似，特別是正電子發射計算機斷層顯像（PET-CT）上，肉芽腫性病變呈高攝取，標準化攝取值（SUV）類似惡性腫瘤，需要與腫瘤性疾病鑒別［20］。當然，仍需進一步的研究，以探究機體發生結核分枝桿菌感染時的免疫反應與感染部位的關系。

需要注意的是，結核病的大體觀察、組織學表現及細胞學表現雖然具有一定的特異性，但所有上述表現亦可出現在其他感染性和非感染性肉芽腫性病變中。所以常規的病理學診斷手段并非結核病診斷的金標準，必須通過其他輔助檢查找到結核病病原學依據方可確診［3］。本研究對FFPE 標本結核分枝桿菌熒光PCR、抗酸染色、分枝桿菌菌種鑒定、血液T-SPOT及血清學結核抗體在肺外結核檢測中的陽性率進行了比較。與既往的相關報道相同［21］，FFPE 標本結核分枝桿菌熒光PCR 檢測的陽性率（91.3%）明顯高于抗酸染色（77.5%）。眾所周知，抗酸染色靈敏度低、特異性差，需10 000個/毫升的菌量方能獲得陽性結果，且結果受判讀者的主觀因素影響較大，易造成漏診或誤診［22］。熒光PCR 技術是針對MTB 的核酸進行檢測，其靈敏度可提高至10 個/毫升MTB，且試劑盒設計時選擇相對保守的病原體核酸片段，進行PCR 擴增與熒光信號收集，特異性強且重復性好［21］。且在臨床診療過程中發現，FFPE 標本結核分枝桿菌熒光PCR 陽性比僅抗酸染色單陽更有助于結核病的診斷。分枝桿菌菌種鑒定技術，該方法設計針對特定同源基因或序列（16rDNA）的單核苷酸多態性位點的探針，并將探針標記在固相的基質上（纖維素膜），通過探針與待測序列的結合情況間接判斷DNA 序列的組成，從而達到鑒別菌種的目的［23］。結核分枝桿菌菌種鑒定技術與上述結核分枝桿菌熒光PCR 均屬于分子診斷技術，然而結核分枝桿菌菌種鑒定MTC 的陽性率（61.3%）明顯低于后者（91.3%）。具體原因，仍需進一步探究。FFPE 標本結核分枝桿菌熒光PCR 的陽性率也明顯高于血液T-SPOT（62.5%）和血清學結核抗體（34.6%）。有研究表明病人年齡、性別等一般資料及免疫抑制狀態、惡性腫瘤等基礎疾病對血TSPOT 試驗結果和血清學結核抗體結果均產生一定的影響，故其在診斷結核病方面存在一定局限性［24］。由此可見，FFPE標本結核分枝桿菌熒光PCR技術在檢測EPTB 結核分枝桿菌中有顯著優勢，該技術的應用對EPTB早期診斷有較高的價值。

綜上所述，肺外結核臨床特征缺乏特異性，全身多器官、組織均可發生，臨床表現以系統局部癥狀為主，全身中毒癥狀少見。組織學病理改變結合FFPE 標本結核分枝桿菌熒光PCR 檢測對提高肺外結核的診斷效率有重要價值。