姜黃素通過(guò)上調(diào)miR-124減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷

簡(jiǎn)宇，范婷，代凌云，趙春虎

作者單位：長(zhǎng)江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院急診科，湖北 荊州 434000

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是常見(jiàn)危重癥呼吸系統(tǒng)疾病，主要以低氧血癥和進(jìn)行性呼吸窘迫為臨床特征，病死率高達(dá)30%～45%［1-2］。其病因多樣、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，但研究表明，炎癥反應(yīng)在ALI 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3］。姜黃素（curcumin，Cur）是廣泛存在于姜黃、莪術(shù)、郁金等中藥根莖中的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性，已有研究證實(shí)，Cur 可有效減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)及膿毒癥相關(guān)ALI，在肺部疾病中具有良好的應(yīng)用前景，但其具體作用機(jī)制尚不清楚［4-5］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過(guò)對(duì)其靶基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮生物學(xué)功能，其中miR-124 是一個(gè)重要炎癥相關(guān)miRNA［6］，有研究報(bào)道，miR-124 可靶向抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）抑制下游核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）發(fā)揮抗炎作用［7-8］，但Cur 是否也通過(guò)該通路對(duì)ALI 大鼠發(fā)揮保護(hù)作用，尚未可知。因此本研究自2019 年9 月至2020 年5 月探究Cur 對(duì)LPS 誘導(dǎo)ALI大鼠的保護(hù)作用及對(duì)miR-124及其下游靶基因的表達(dá)影響，以期揭示其作用機(jī)制，為優(yōu)化Cur臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 8 周齡健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量范圍為290～310 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005，使用許可證號(hào)SYXK（滬）2017-0008。本研究符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383來(lái)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑及儀器 Cur（貨號(hào)HY-N0005，純度96.31%）購(gòu)自MCE 公司；LPS（貨號(hào)L2630）購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，貨號(hào)10099141）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA 提取試劑盒（貨號(hào)R0011）購(gòu)自上海碧云天有限公司；Prime-Script ?RT reagent Kit（Perfect Real Time）（貨號(hào)RR037A）、microRNA 定量試劑盒（貨號(hào)638315）、TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（貨號(hào)RR820A）購(gòu)自TaKaRa 生物公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000Reagent（貨號(hào)11668）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；miR-124 模擬物及其陰性對(duì)照（miR-124 mimic/NC）、miR-124抑制劑及其陰性對(duì)照（miR-124 inhibitor/inhibitor-NC）及miR-124、U6、TRAF6、GAPDH引物均由廣州銳博生物科技有限公司提供；大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（貨號(hào)ab236712）、IL-6 ELISA 試劑盒（貨號(hào)ab234570）、兔源一抗anti-TRAF6（貨號(hào)ab40675）、anti-β-actin（ab8227）、二抗羊抗兔IgG（貨號(hào)ab6721）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；MODEL550 型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；Forma Steri-Cycle i160 二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；ix75 熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司等。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) NR8383 細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后采用含20%FBS、1%P/S Ham's F-12K 培養(yǎng)基置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，用0.05%胰蛋白酶消化處理以1∶3 比例進(jìn)行傳代。

1.3.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建與miR-124種子區(qū)結(jié)合的TRAF6 基因3’UTR 野生型（Pmir-GLO-TRAF6-Wt）和突變型（Pmir-GLO-TRAF6-Mut）雙熒光報(bào)告載體。構(gòu)建PmiR-GLO-TRAF6 野生型和突變型重組載體后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miRNA（miR-124 mimic 或NC）和重組載體（野生型或突變型）共轉(zhuǎn)染入NR8383 細(xì)胞中，于二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每組設(shè)立5 個(gè)復(fù)孔，48 h 后用PLB 裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，離心后取上清檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素信號(hào)和海腎熒光素信號(hào)，以海腎熒光素酶活性為對(duì)照，計(jì)算其相對(duì)活性。

1.3.3 ALI 大鼠模型建立及分組 SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（NC 組）、LPS 組、LPS+Cur組、LPS+Cur+inhibitor-NC 組、LPS+Cur+inhibitor 組，每組10 只。LPS 組腹腔注射LPS 10 mg/kg 制備ALI大鼠模型［9］，LPS+Cur組在ALI模型制備30 min后尾靜脈注射Cur 200 mg/kg，LPS+Cur+inhibitor-NC 組、LPS+Cur+inhibitor 組大鼠尾靜脈分別注射miR-124 inhibitor-NC、miR-124 inhibitor 50 mg/kg 1 周后腹腔注射LPS 10 mg/kg，30 min 后尾靜脈注射Cur 200 mg/kg，NC 組注射等量生理鹽水30 min 后尾靜脈注射等量生理鹽水。24 h 后腹腔麻醉處死大鼠，分別采集心臟血及肺組織標(biāo)本待檢。

1.3.4 HE 染色觀察肺組織病理學(xué)變化 取部分肺組織于4%多聚甲醛中固定，進(jìn)行石蠟包埋，切片（4μm），蘇木精-伊紅（HE）染色，于光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.3.5 ELISA 檢測(cè)血清TNF-α、IL-6 水平 常規(guī)分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.6 RT-qPCR 檢測(cè)肺組織miR-124、TRAF6 mRNA 表達(dá)水平 采用RNA 提取試劑盒提取肺組織總RNA，濃度及純度檢測(cè)合格后，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎脤?shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）擴(kuò)增miR-124、TRAF6 mRNA 目的片段。RT-qPCR 采用20μL反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4μL，cDNA（50μg/L）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.0μL。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)肺組織miR-124、TRAF6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測(cè)肺組織TRAF6 蛋白表達(dá) 采用蛋白抽提試劑盒提取肺組織總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg 蛋白樣品，進(jìn)行6%SDS-PAGE 電泳后PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，添加一抗（anti-TRAF6，稀釋比1∶5 000；anti-β-actin，稀釋比1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，洗膜后，添加二抗IgG（稀釋比1∶5 000）室溫孵育1.5 h，洗膜，顯色，曝片，拍照，觀察并分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s 表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步任意兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-124 可靶向TRAF6 基因表達(dá) 通過(guò)TargetScan、miRanda、miRTarBase 在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)TRAF6 基因3 'UTR 區(qū)可能包含miR-124 的互補(bǔ)序列（圖1），提示TRAF6 可能是miR-124 的作用靶點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-124 mimic 和Pmir-GLO-TRAF6 野生型重組質(zhì)粒NR8383細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染miR-124 mimic 和Pmir-GLO-TRAF6 突變型重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染miR-124 NC 和Pmir-GLO-TRAF6 野生及突變型重組質(zhì)粒的NR8383 細(xì)胞的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2），提示miR-124可通過(guò)靶向TRAF6 3 ' UTR 區(qū)負(fù)調(diào)控其表達(dá)，二者存在直接靶向關(guān)系。

圖1 TargetScan預(yù)測(cè)TRAF6 3'UTR中與miR-124結(jié)合序列

圖2 NR8383細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化 NC 組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯異常改變；LPS組、LPS+Cur+inhibitor 組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺間質(zhì)增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，彌漫性充血、滲出，肺泡萎縮；LPS+Cur 組、LPS+Cur+inhibitor-NC 組大鼠肺組織損傷減輕，見(jiàn)圖3。

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平變化 與NC組比較，LPS組大鼠血清TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+Cur 組大鼠血清TNF-α、IL-6 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與LPS+Cur+inhibitor-NC組比較，LPS+Cur+inhibitor組大鼠血清TNF-α、IL-6 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）表達(dá)水平變化/（ng/L，±s）

表1 各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）表達(dá)水平變化/（ng/L，±s）

注：①與NC 組比較，P＜0.05。②與LPS 組比較，P＜0.05。③與LPS+Cur+inhibitor-NC組比較，P＜0.05。

IL-6 5.49±1.06 32.74±2.27①21.44±2.12①②21.65±2.18①②28.97±2.29①②③262.99＜0.001組別NC組LPS組LPS+Cur組LPS+Cur+inhibitor-NC組LPS+Cur+inhibitor組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 10 TNF-α 6.14±1.21 45.28±4.85①29.26±2.72①②29.87±2.59①②34.59±3.02①②③212.52＜0.001

2.4 各組大鼠肺組織miR-124、TRAF6 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較 與NC 組比較，LPS組大鼠肺組織miR-124 表達(dá)水平顯著降低、TRAF6 mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+Cur 組大鼠肺組織miR-124 表達(dá)水平顯著增加、TRAF6 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與LPS+Cur+inhibitor-NC 組比較，LPS+Cur+inhibitor 組大鼠肺組織miR-124 表達(dá)水平顯著降低、TRAF6 mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.5 各組大鼠肺組織TRAF6 蛋白表達(dá)量比較 與NC組比較，LPS組大鼠肺組織TRAF6蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+Cur 組大鼠肺組織TRAF6蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與LPS+Cur+inhibitor-NC 組比較，LPS Cur+inhibitor 組大鼠肺組織TRAF6 蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖4，表2。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組大鼠肺組織TRAF6蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠肺組織微小RNA-124（miR-124）與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）相對(duì)表達(dá)水平比較/±s

表2 各組大鼠肺組織微小RNA-124（miR-124）與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）相對(duì)表達(dá)水平比較/±s

注：①與NC 組比較，P＜0.05。②與LPS 組比較，P＜0.05。③與LPS+Cur+inhibitor-NC組比較，P＜0.05。

組別NC組LPS組LPS+Cur組LPS+Cur+inhibitor-NC組LPS+Cur+inhibitor組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 miR-124 1.01±0.09 0.37±0.04①0.74±0.06①②0.73±0.07①②TRAF6 mRNA 0.99±0.07 5.15±0.53①3.51±0.32①②3.56±0.34①②TRAF6蛋白0.11±0.01 1.07±0.10①0.38±0.04①②0.37±0.03①②10 0.48±0.04①②③4.67±0.41①②③0.45±0.04①②③447.11＜0.001 157.90＜0.001 192.86＜0.001

3 討論

ALI 是外傷、感染、膿毒癥等一系列刺激因素引起的復(fù)雜呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要以肺內(nèi)炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致的嚴(yán)重低氧血癥、彌漫性肺損傷、肺水腫等為主要病理特征，伴隨一系列基因表達(dá)失調(diào)等，但尚未完全明確［10］。目前臨床尚缺乏ALI特效療法，因此積極探究新型治療方案，并深入研究其作用機(jī)制具有重要意義。肺泡巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫在ALI發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要成分，是內(nèi)毒素和重要群特異性抗原，LPS 感染機(jī)體刺激肺組織可活化肺泡巨噬細(xì)胞膜上Toll 樣受體（TLRs），繼而通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致ALI發(fā)生［11-12］。本研究顯示，LPS組大鼠肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，肺間質(zhì)增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，彌漫性充血、滲出，肺泡萎縮，且血清促炎因子TNF-α、IL-6 表達(dá)水平顯著增加，提示LPS 誘導(dǎo)ALI 模型成功。而Cur 可減輕ALI大鼠肺組織病理變化及TNF-α、IL-6 炎性因子分泌。Cur 是一種具有抗炎、抗氧化、抗血脂、抗腫瘤等多種功能的膳食多酚，研究表明，Cur 可通過(guò)上調(diào)線粒體融合蛋白2減輕膿毒癥小鼠ALI［13］，還可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路減輕流感病毒感染引起的巨噬細(xì)胞活化和肺部炎癥［14］，且對(duì)LPS 誘導(dǎo)的ALI 有顯著治療作用［15］，提示Cur 可減輕LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI，減輕肺組織炎癥反應(yīng)。

MiRNAs 在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，主要通過(guò)識(shí)別靶基因3'UTR 區(qū)抑制蛋白翻譯或促進(jìn)靶基因降解，在炎癥調(diào)控反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究顯示，MiR-124 在多種細(xì)胞中特異表達(dá)，是一種影響炎癥通路的重要miRNA，與多種炎癥性疾病密切相關(guān)［16-17］，miR-124 靶基因眾多，本研究通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)及文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，miR-124 可靶向抑制TRAF6表達(dá)發(fā)揮抗狼瘡性腎炎［18］、ALI 肺泡巨噬細(xì)胞炎癥［19］等作用，本研究經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與其他對(duì)照組比較，共轉(zhuǎn)染miR-124 mimic和Pmir-GLO-TRAF6 野生型重組質(zhì)粒NR8383 細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低，提示TRAF6 是miR-124的直接作用靶點(diǎn)。TRAF6 是TLR4 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白，TRAF6 激活可進(jìn)而引起TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子免疫應(yīng)答，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，與肺損傷成正相關(guān)［20］。本研究結(jié)果顯示，與NC 組比較，LPS組大鼠肺組織miR-124 表達(dá)水平顯著降低，TRAF6 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著增加，而Cur 處理可顯著增加miR-124 表達(dá)，抑制TRAF6 mRNA 及蛋白表達(dá)，提示Cur 可能通過(guò)促進(jìn)miR-124 表達(dá)抑制TRAF6 表達(dá)，減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠肺組織炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究在LPS+Cur 基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor-NC 對(duì)照比較，轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor 可顯著降低Cur 治療效果，進(jìn)一步驗(yàn)證Cur 可通過(guò)miR-124/TRAF6 軸發(fā)揮作用，但可能不是唯一途徑，具體相關(guān)通路有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，Cur 可通過(guò)上調(diào)miR-124 靶向抑制TRAF6 減輕LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 及炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療作用。但是否存在其他信號(hào)通路參與，及具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。

（本文圖3見(jiàn)插圖8-2）