載脂蛋白E基因多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血相關(guān)性的Meta分析▲

劉 軍 吳 剛 黃 瑋

(1 廣西柳州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，柳州市 545000，電子郵箱：305302887@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧市 530021)

神經(jīng)系統(tǒng)疾病特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是多因多果的復(fù)雜疾病，近年來其發(fā)病率逐漸升高，備受關(guān)注[1-2]。家系研究表明，有家族史的人群發(fā)生腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[3]；同卵雙生子同時(shí)發(fā)生腦卒中的概率是異卵雙生子的5倍[4]。這提示遺傳因素在腦血管疾病的發(fā)生中具有重要作用。大量基因組學(xué)研究表明，北高加索人群和亞洲人群在腦梗死的遺傳易感性方面存在顯著差異[5-7]，但在腦出血易感基因方面的研究證據(jù)還不足。目前認(rèn)為，載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因多態(tài)性在蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。但由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法不同，樣本量大小不一，結(jié)論仍然備受爭(zhēng)議。為了闡明ApoE基因多態(tài)性與腦出血之間的關(guān)系，以及北高加索人群與亞洲人群之間該基因多態(tài)性的差異，本研究擬通過對(duì)已發(fā)表的ApoE基因多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血的相關(guān)研究進(jìn)行Meta分析，以期獲得較為客觀的結(jié)論。

1 材料與方法

1.1 檢索策略 以subarachnoid hemorrhage、apolipoprotein E、APOE、polymorphism、mutation、variant為英文檢索詞，組合檢索PubMed、Web of Science、Embase和Cochrane Library數(shù)據(jù)庫。以“蛛網(wǎng)膜下腔出血”“載脂蛋白E”和“多態(tài)性”為中文檢索詞，組合檢索中國知網(wǎng)(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)和萬方數(shù)據(jù)庫。檢索時(shí)間為1990年1月1日至2019年2月20日。文種語言僅限于中文和英文。同時(shí)手工檢索納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)。

1.2 文獻(xiàn)的納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)文獻(xiàn)的研究類型為病例對(duì)照研究；(2)文獻(xiàn)研究對(duì)象分為病例組和對(duì)照組，病例組為明確診斷為蛛網(wǎng)膜下腔出血的患者，對(duì)照組為正常人群；(3)暴露因素為ApoE基因多態(tài)性；(4)結(jié)局指標(biāo)為蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)，只納入最近的1篇；(2)未提供基因型分布情況和主要結(jié)局等數(shù)據(jù)；(3)病例組或?qū)φ战M樣本數(shù)較少(<30例)；(4)遺傳家系；(5)學(xué)位論文、會(huì)議摘要、綜述，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等；(6)非中文或英文文獻(xiàn)；(7)基因型分布頻率不符合哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)定律。

1.3 文獻(xiàn)篩選和偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià) 由2名文獻(xiàn)評(píng)價(jià)員獨(dú)立篩選文獻(xiàn)、提取資料并進(jìn)行核對(duì)，然后使用紐卡斯?fàn)?渥太華量表(Newcastle-Ottawa Scale,NOS)[8]對(duì)納入的文獻(xiàn)進(jìn)行偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，任一步驟意見不統(tǒng)一時(shí)均討論解決。NOS評(píng)分≥6分視為納入文獻(xiàn)的質(zhì)量較好。

1.4 數(shù)據(jù)提取 資料提取的內(nèi)容包括發(fā)表時(shí)間、作者、研究實(shí)施的國家、人群，病例組和對(duì)照組的樣本量，ApoE基因各等位基因和基因型分布頻率等。ApoE基因是由3個(gè)等位基因(ε2、ε3、ε4)構(gòu)成，共有6種基因型(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)，其中ε3/3為野生型，ε2/2、ε4/4為純合突變型，ε2/3、ε2/4、ε3/4為雜合突變。本文以ε3(ε3/3)為參考，運(yùn)用以下8個(gè)模型分析ApoE基因ε2、ε4等位基因多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性的關(guān)系。(1)ε2顯性模型(ε2/2+ε2/3+ε2/4和ε3/3)；(2)ε2等位基因模型(ε2和ε3)； (3)ε4顯性模型(ε2/4+ε3/4+ε4/4和ε3/3)；(4)ε4等位基因模型(ε4和ε3)；(5)ε2/2純合子模型(ε2/2和ε3/3)； (6)ε4/4純合子模型(ε4/4和ε3/3)；(7)ε2隱性模型(ε2/2和ε2/3+ε2/4+ε3/3)；(8)ε4隱性模型(ε4/4和ε2/4+ε3/4+ε3/3)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用比值比(odds ratio,OR)及其95%CI評(píng)價(jià)ApoE基因多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。對(duì)納入文獻(xiàn)的對(duì)照組基因型分布頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，判斷其是否符合HWE定律，P>0.05則認(rèn)為符合HWE定律，說明樣本具有群體代表性。采用Q檢驗(yàn)和I2檢驗(yàn)分析各研究之間的異質(zhì)性：若P>0.1或I2≤50%，說明各研究之間沒有明顯異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；反之則采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；采用敏感性分析評(píng)估合并結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。采用Egger直線回歸法檢驗(yàn)發(fā)表偏倚，若P>0.05，提示發(fā)表偏倚不顯著，并繪制漏斗圖。使用R軟件的GWASExact HW程序包計(jì)算[9]HWE，通過Review Manager 5.3建立森林圖，采用Stata 15.0軟件進(jìn)行其余的分析。Meta分析的結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)218篇，經(jīng)過納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)逐層篩選，最終納入7篇文獻(xiàn)[10-16](Fayed等[17]的研究因納入樣本數(shù)太少被排除，Kokubo等[18]和Suvatha等[19]的研究因不滿足HWE定律被排除)。檢索和篩選流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)檢索和篩選流程圖

2.2 納入研究的基本特征及偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果 納入的7篇文獻(xiàn)中有4篇[10，13-15]對(duì)北高加索人群進(jìn)行分析，有3篇[11-12，16]對(duì)亞洲人群進(jìn)行分析；納入分析的病例組852例，對(duì)照組1 420例。χ2檢驗(yàn)結(jié)果均顯示P>0.05 ，提示基因型分布頻率均符合HWE定律。偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果示，1篇文獻(xiàn)的NOS評(píng)分為6分[10]，2篇的NOS評(píng)分為7分[11-12]，其余4篇文獻(xiàn)的NOS評(píng)分為8分[13-16]，提示納入文獻(xiàn)的質(zhì)量較好。納入研究的基本特征及偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果見表1。

表1 納入研究的基本特征及偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3 ε2顯性模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε2顯性模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=37%，P=0.14)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，ε2顯性模型沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.07，95%CI：0.83,1.37；P=0.60)。亞組分析結(jié)果顯示，ε2顯性模型對(duì)亞洲人群及北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性均無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對(duì)稱，Egger檢驗(yàn)結(jié)果顯示P=0.504，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖2。

圖2 ε2顯性模型分析結(jié)果

2.4 ε4顯性模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε4顯性模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=29%，P=0.21)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，ε4顯性模型沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.03，95%CI：0.83，1.28；P=0.79)。亞組分析結(jié)果顯示，ε4顯性模型對(duì)亞洲人群與北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性均無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對(duì)稱，Egger檢驗(yàn)結(jié)果顯示P=0.702，提示納入的研究沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖3。

圖3 ε4顯性模型分析結(jié)果

2.5 ε2等位基因模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε2等位基因模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=42%，P=0.11)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，與ε3等位基因相比，ε2等位基因沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.10,95%CI:0.88，1.38；P=0.41)。亞組分析結(jié)果顯示，ε2等位基因模型對(duì)亞洲人群與北高加索人蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性均無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對(duì)稱，Egger檢驗(yàn)結(jié)果顯示P=0.237，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖4。

圖4 ε2等位基因模型分析結(jié)果

2.6 ε4等位基因模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε4等位基因模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=40%，P=0.12)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析，結(jié)果顯示，與ε3等位基因相比，ε4等位基因沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.04，95%CI：0.86，1.25；P=0.71)。亞組分析結(jié)果顯示，ε4等位基因模型對(duì)亞洲人群與北高加索人蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性均無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對(duì)稱，Egger檢驗(yàn)結(jié)果顯示P=0.697，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖5。

圖5 ε4 等位基因模型分析結(jié)果

2.7 ε2/2純合子模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε2/2純合子模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=0%，P=0.44)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示以ε3/3基因型為對(duì)照，ε2純合子突變沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.74，95%CI：0.76，3.97；P=0.19)。亞組分析結(jié)果顯示，ε2/2 純合子突變?cè)黾恿吮备呒铀魅酥刖W(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=3.27，95%CI：1.08，9.88；P=0.04)，而對(duì)亞洲人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性無顯著影響(OR=0.72，95%CI：0.18，2.80；P=0.63)。漏斗圖基本對(duì)稱，Egger檢驗(yàn)結(jié)果顯示P=0.504，提示各研究沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析結(jié)果提示，移除文獻(xiàn)[13]后對(duì)分析結(jié)果影響較大，結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。見圖6。

圖6 ε2/2純合子模型分析結(jié)果

2.8 ε4/4純合子模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε4/4純合子模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=0%，P=0.71)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，以ε3/3為對(duì)照，ε4/4純合子突變沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.00,95%CI：0.52，1.92；P=0.99)。亞組分析結(jié)果顯示，ε4/4純合子突變模型對(duì)亞洲人群和北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對(duì)稱，Egger檢驗(yàn)結(jié)果顯示P=0.504，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖7。

圖7 ε4/4純合子模型分析結(jié)果

2.9 ε2 隱性模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε2隱性模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=0%，P=0.43)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示：ε2 隱性模型沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=1.73，95%CI：0.76，3.95；P=0.19)。亞組分析結(jié)果顯示，ε2 隱性模型增加了北高加索人蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=3.37，95%CI：1.12，10.19；P=0.03)，而對(duì)亞洲人群無顯著影響(OR=0.69，95%CI：0.18，2.69；P=0.60)。漏斗圖基本對(duì)稱，Egger檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示P=0.213，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析結(jié)果提示移除文獻(xiàn)[13]后對(duì)分析結(jié)果影響較大，結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。見圖8。

圖8 ε2 隱性模型分析結(jié)果

2.10 ε4 隱性模型分析結(jié)果 7篇文獻(xiàn)[10-16]均分析了ε4隱性模型，各研究之間不存在明顯的異質(zhì)性(I2=0%，P=0.79)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；結(jié)果顯示，ε4隱性模型沒有增加蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性(OR=0.98，95%CI：0.51，1.89；P=0.96)。亞組分析結(jié)果顯示，ε4隱性模型對(duì)亞洲人群與北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性無顯著影響(均P>0.05)。漏斗圖基本對(duì)稱，Egger檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示P=0.615，提示沒有明顯的發(fā)表偏倚。敏感性分析提示結(jié)果可靠。見圖9。

圖9 ε4 隱性模型分析結(jié)果

3 討 論

ApoE基因位于人類基因的第19號(hào)染色體上，全長3.7 kb，含有4個(gè)外顯子。ApoE基因突變較為常見[20]。ApoE ε2等位基因的112位點(diǎn)和158位點(diǎn)均是半胱氨酸，ApoE ε3等位基因的112位點(diǎn)是半胱氨酸，而158位點(diǎn)是精氨酸，ApoE ε4等位基因的112位點(diǎn)和158位點(diǎn)均是精氨酸。因此，ApoE等位基因分布頻率不同決定了不同人群中ApoE基因表型的差異。研究表明，ApoE基因的多態(tài)性與顱內(nèi)出血有一定的相關(guān)性，但顱內(nèi)不同部位的出血可能存在差異[12]。其中最值得關(guān)注的是ApoE ε4等位基因。研究顯示，腦葉的出血多與攜帶ApoE ε4等位基因及血管內(nèi)β淀粉樣蛋白酶沉積有關(guān)[21-22]。一項(xiàng)針對(duì)基因多態(tài)性與腦出血之間相關(guān)性的Meta分析結(jié)果提示，攜帶ApoE ε4等位基因與腦出血之間存在關(guān)聯(lián)，而攜帶ApoE ε2等位基因與腦出血之間并無相關(guān)性[23]。Maxwell等[24]的Meta分析結(jié)果顯示，ApoE ε4等位基因與腦葉微出血(腦實(shí)質(zhì)內(nèi)部出血)的相關(guān)程度較高，同時(shí)ApoE ε4等位基因與血管淀粉樣變相關(guān)，由此推測(cè)腦葉微出血可以作為血管淀粉樣變所致腦出血的標(biāo)志。然而，與腦葉出血不同的是，80%的蛛網(wǎng)膜下腔出血是由于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂所致[25]。這或?yàn)楸狙芯恐蠥poE ε4等位基因突變并沒有增加北高加索人和亞洲人蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性的原因之一。本研究結(jié)果顯示，ApoE基因的ε2純合子突變?cè)黾恿吮备呒铀魅酥刖W(wǎng)膜下腔出血的易感性，而對(duì)亞洲人群無顯著影響；ApoE ε2隱性模型也增加了北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性，而對(duì)亞洲人群蛛網(wǎng)膜下腔出血的易感性無顯著影響。這提示ApoE ε2純合子突變和隱性模型對(duì)北高加索人群和亞洲人群蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性的影響存在差異。同時(shí)，這一結(jié)果也提示，除了ApoE基因之外，不同人群之間蛛網(wǎng)膜下腔出血相關(guān)基因可能存在差異，這或與環(huán)境因素有關(guān)。然而，傳統(tǒng)的遺傳關(guān)聯(lián)研究，往往只能發(fā)現(xiàn)常見變異的相關(guān)位點(diǎn)，而不能進(jìn)一步探索未知的位點(diǎn)。這可能會(huì)遺漏有陽性關(guān)聯(lián)甚至效應(yīng)較大的未知基因位點(diǎn)。隨著全基因組測(cè)序等高通量基因分型平臺(tái)的建立及國際人類基因圖譜的完成，全基因組關(guān)聯(lián)分析越來越受到科學(xué)家的關(guān)注，將來可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的腦出血相關(guān)基因位點(diǎn)。

本研究采用Meta分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，制定了嚴(yán)格的文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，將ApoE基因多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血的相關(guān)研究進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)和量化。結(jié)果顯示，本研究納入文獻(xiàn)的基因型分布頻率均符合HWE定律，提示研究人群具有代表性，結(jié)果可靠。此外，本研究應(yīng)用固定效應(yīng)模型進(jìn)行總體效應(yīng)值的估計(jì)，經(jīng)Egger直線回歸和漏斗圖檢驗(yàn)發(fā)表偏倚，結(jié)果均提示各研究間不存在發(fā)表偏倚，因而判斷結(jié)果較準(zhǔn)確。但本研究方法也存在一定的不足：首先，納入Meta分析的研究樣本量比較有限，證據(jù)強(qiáng)度稍低；其次，納入分析的研究大多數(shù)為原始研究，均沒有對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血的解剖學(xué)因素進(jìn)行篩選，因此可能無法完全排除血管畸形等血管結(jié)構(gòu)異常所致的出血性患者。

綜上所述，ApoE基因的ε2純合子突變和隱性模型與北高加索人群蛛網(wǎng)膜下腔出血易感性相關(guān)，但對(duì)亞洲人群蛛網(wǎng)膜下腔易感性無明顯影響。應(yīng)注意識(shí)別不同人群間ApoE基因的突變情況，預(yù)測(cè)蛛網(wǎng)膜下腔出血，并給予早期干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。