光滑假絲酵母菌多效耐藥1基因介導的氟康唑耐藥機制研究進展▲

夏翠萍 張 可 王金宇 王中新

(安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科，合肥市 230032，電子郵箱：13155233015@163.com)

【提要】 氟康唑耐藥率和致死率呈現上升趨勢，受到學者們越來越多的關注。光滑假絲酵母菌是臨床念珠菌血癥重要的致病菌種，多效耐藥1(PDR1)基因功能獲得性突變導致外排泵轉運蛋白過表達，在光滑假絲酵母菌對氟康唑的耐藥機制中發揮重要作用，但目前對PDR1調節機制及突變情況的了解并不全面。本文從光滑假絲酵母菌PDR1基因介導的氟康唑耐藥機制、PDR1的調控機制及PDR1功能獲得性突變對菌株毒力的影響三個方面，闡述光滑假絲酵母菌PDR1基因介導的氟康唑耐藥機制。

白色假絲酵母菌是臨床侵襲性真菌感染的最主要病原體，但近年來，非白色假絲酵母菌感染率逐漸上升，其中光滑假絲酵母菌成為僅次于白色假絲酵母菌的常見致病性酵母菌[1]。在血液系統惡性腫瘤、糖尿病和需要腸外營養支持等患者中，光滑假絲酵母菌的感染率已超過白色假絲酵母菌[2-3]。臨床上抗真菌藥物種類少，三唑類藥物是臨床最常用的抗真菌藥物，其中氟康唑具有口服效果好、毒性弱、不良反應少等優點，成為臨床治療真菌感染的一線藥物。光滑假絲酵母菌是口腔黏膜的正常菌群，其具有對三唑類藥物敏感性低及耐受性強等特點，因而耐藥率更高，這導致光滑假絲酵母菌感染患者的臨床預后較差。近年來，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑的大量應用，光滑假絲酵母菌對三唑類藥物的耐藥率逐漸增加[4-5]，導致棘白菌素類藥物成為治療光滑假絲酵母菌的主要抗真菌藥。但最近的研究表明，光滑假絲酵母菌對棘白菌素類藥物的耐藥率也逐漸上升，并且棘白菌素類耐藥菌株同時也對三唑類耐藥[6-7]。因此，進一步研究光滑假絲酵母菌對氟康唑的耐藥機制，探索抑制耐藥的新靶點，是當前亟須解決的問題。本文從光滑假絲酵母菌多效耐藥(pleiotropic drug resistance,PDR)1基因介導的氟康唑耐藥機制、PDR1基因的多種調控機制及PDR1基因功能獲得性突變對毒力的影響三個方面，闡述光滑假絲酵母菌PDR1基因調節氟康唑的耐藥機制。

1 PDR1基因介導的耐藥機制

光滑假絲酵母菌對氟康唑耐藥的主要機制是PDR1基因發生功能獲得性突變，從而導致外排泵轉運蛋白的過表達[8]。外排泵轉運蛋白包括三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)結合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉運蛋白和主要協助轉運蛋白超家族(major facilitator superfamily，MFS)，其中ABC轉運蛋白包括CDR1p、CDR2p和SNQ2p，其編碼基因分別為CDR1、CDR2和SNQ2，ABC轉運蛋白在光滑假絲酵母菌對氟康唑的耐藥中發揮主要作用[9]。PDR5基因是PDR1基因與ABC轉運蛋白編碼基因的結合位點，PDR1基因可激活PDR5基因介導光滑假絲酵母菌對多種藥物耐藥。CgPdr1p為鋅簇DNA結合區域轉錄因子，參與下游基因的轉錄調控，PDR反應元件(PDR response elements，PDRE)包括PDRE1和PDRE2，位于PDR1基因序列的上游，在調節PDR1基因介導的耐藥方面，PDRE2作用大于PDRE1[10]。CDR1、CDR2、SNQ2基因序列同樣包含PDRE，啟動子通過結合CDR1、CDR2、SNQ2基因序列上的PDRE介導氟康唑的外排作用。敲除PDRE可增加光滑假絲酵母菌對氟康唑的敏感性[10]。PDR1基因通過激活下游靶基因CDR1、CDR2、SNQ2過表達介導外排泵耐藥，其中CDR1在外排泵耐藥中起主要作用，CDR2的作用次之，SNQ2的作用較小[11-12]。Whaley等[13]研究發現，與敲除ABC轉運蛋白上的CDR1、CDR2、SNQ2基因相比，敲除PDR1基因后光滑假絲酵母菌對氟康唑的敏感性更高，提示PDR1基因不僅可以通過功能獲得性突變介導下游外排泵轉運蛋白編碼基因CDR1、CDR2、SNQ2過表達，從而引起病原體發生耐藥。PDR1基因還可能通過其他途徑介導氟康唑耐藥機制，但需進一步研究。

2 PDR1基因的調控機制

PDR1基因是光滑假絲酵母菌對氟康唑耐藥的中心調控因子，主要通過以下3個方面發揮作用：(1)與氟康唑直接結合[14]，即PDR1基因可以直接與氟康唑結合，導致光滑假絲酵母菌對氟康唑耐藥；(2)引起光滑假絲酵母菌的線粒體編碼基因缺失，使得線粒體功能障礙，導致ABC轉運蛋白表達上調[15]；(3)PDR1基因發生功能獲得性突變。PDR1基因功能獲得性突變介導的外排泵蛋白過表達是光滑假絲酵母菌對氟康唑耐藥的主要原因。PDR1基因功能獲得性突變產生的氨基酸替代性突變上調下游靶基因，是CDR1過表達介導耐藥的主要機制之一。光滑假絲酵母菌PDR1基因與釀酒酵母菌PDR1基因、PDR3基因的同源性很高[16]，雖然與釀酒酵母菌PDR3基因同源性更高，但是其調控功能(為自動調控)更接近于釀酒酵母菌PDR1。PDR1基因的功能區域主要有3個部分：羧基末端(即激活區)、中間同源區(middle homology region，MHR)和DNA結合區。PDR1基因的功能獲得性突變主要發生在羧基末端和MHR[17]，轉錄共激活因子MedA15通過激酶誘導結合域與PDR1羧基末端結合，在PDR1基因介導的轉錄激活中發揮重要作用。研究發現，對羧基末端三倍體進行修飾可以提高光滑假絲酵母菌對氟康唑的敏感性，而對羧基末端一倍體和PDR1氨基端進行修飾則降低了光滑假絲酵母菌對氟康唑的敏感性[18]，可能原因是羧基末端三倍體修飾改變了PDR1的細胞定位，使PDR1基因從細胞核轉移到細胞漿，從而使PDR1基因的自動調控功能降低。敲除MHR會使光滑假絲酵母菌處于一種高毒性的狀態[17]，在這種情況下光滑假絲酵母菌可因不能耐受自身毒性而死亡。說明光滑假絲酵母菌的PDR1基因即使在發生功能獲得性突變后仍存在負調控，否則光滑假絲酵母菌會產生毒性導致自身死亡，而這種功能獲得性突變超過了PDR1正常的負調控或者改變了具有負調控功能的蛋白的結構，從而導致耐藥的發生。PDR1的功能獲得性突變主要是通過激活下游靶基因CDR1介導耐藥的發生，但Simonicova等[19]發現PDR1基因的羧基末端發生的兩個突變，即D1082G和LWG1079AA位點突變，并不是嚴格意義上的功能獲得性突變，因為D1082G和LWG1079AA位點突變可降低光滑假絲酵母菌的耐藥性。

麥角固醇生物合成途徑在光滑假絲酵母菌對氟康唑耐藥方面也發揮重要作用，氟康唑的抗菌作用機制主要是通過與14α-去甲基化酶結合，抑制光滑假絲酵母菌細胞膜脂質的合成，從而起到抑制真菌生長作用。麥角固醇11是麥角固醇生物合成途徑的編碼基因，其通過編碼關鍵酶14α-去甲基化酶來調節細胞膜脂質的合成。Upc2是麥角固醇通路的主要調節因子，Upc2通過促進麥角固醇11的合成維持細胞膜脂質的正常結構和功能[20]。Vu等[21]發現，當麥角固醇11活性受抑制(如氟康唑處理)時，Upc2通過結合麥角固醇11、PDR1、CDR1啟動子，從而參與PDR1基因介導光滑假絲酵母菌對氟康唑的耐藥。由此可知，Upc2是連接麥角固醇生物合成和PDR1基因調控外排泵耐藥協同作用的中間調節因子。Jjj1和Bre5是PDR1基因的負調節蛋白[22-23]。敲除劑量依賴性敏感的光滑假絲酵母菌株的Jjj1基因會導致光滑假絲酵母菌對氟康唑耐藥，且ABC轉運蛋白CDR1p和CDR2p表達量分別增加16倍和4倍，而Snq2p的表達沒有顯著改變[22]。雖然Jjj1可通過抑制PDR1基因介導的CDR1激活來參與光滑假絲酵母菌對氟康唑的耐藥，但仍有部分PDR1基因不受Jjj1的影響。Bre5是去泛素化酶復合物的組成部分，與泛素化特異性蛋白酶Ubp3共同參與蛋白質的泛素化修飾，Bre5和Ubp3組成的復合物參與轉錄因子TFⅡD和RNA聚合酶Ⅱ的泛素化[24]，Bre5可抑制PDR1基因對CDR1的激活，這表明PDR1可能受泛素化修飾作用的調節。

3 PDR1基因功能獲得性突變對光滑假絲酵母菌毒力的影響

PDR1基因的功能獲得性突變可增強光滑假絲酵母菌的毒力和侵襲力，與感染野生菌株相比，感染PDR1基因突變的光滑假絲酵母菌的小鼠的組織損傷程度加重、臟器感染的菌量明顯增加，并且不同的功能獲得性突變對光滑假絲酵母菌毒力的影響并不相同[25-27]。由此可見，PDR1基因發生功能獲得性突變后光滑假絲酵母菌具有更強的致病性。EPA1是一種編碼黏附素的基因。研究發現，PDR1基因的功能獲得性突變增強了光滑假絲酵母菌對上皮細胞的黏附力，同時EPA1基因的表達量也發生了上調，表明PDR1基因的功能獲得性突變可能通過上調黏附基因EPA1的表達從而增強光滑假絲酵母菌的毒力[28]。但Tian等[29]卻研究發現，PDR1 基因的G346D位點發生功能獲得性突變后反而降低了EPA1基因的表達和光滑假絲酵母菌對上皮細胞的黏附作用。但目前對PDR1基因功能獲得性突變的研究有限，并且對于多位點發生突變后光滑假絲酵母菌的毒力如何變化，也了解甚少。根據上述文獻，D1082G和LWG1079AA位點突變可降低光滑假絲酵母菌的耐藥性，但這兩個位點突變對黏附性又產生何種影響，光滑假絲酵母菌PDR1基因發生不同功能獲得性突變后其耐藥性和對宿主細胞的黏附力的影響是否一致，都需要進一步的研究。

綜上所述，PDR1基因在光滑假絲酵母菌對氟康唑耐藥中發揮重要作用，但目前對PDR1基因調控機制的研究并不全面，PDR1基因在發生單個位點或多個位點功能獲得性突變后光滑假絲酵母菌的耐藥性和毒力如何變化，仍需進一步探究；同時，探尋新的PDR1基因負性調節因子也是未來研究的重點。但光滑假絲酵母菌對氟康唑耐藥涉及多種機制，是一個多水平作用、多因素調節的復雜過程，單個耐藥基因不能完全解釋光滑假絲酵母菌的耐藥機制，仍需要進一步研究以了解更多的耐藥機制。