高效液相色譜法測定頭孢曲松鈉中2-巰基苯并噻唑含量

王喃喃 許鑫 劉姣 崔成偉

(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，濟寧 272100)

頭孢曲松鈉(ceftriaxone sodium)，屬半合成的第三代頭孢菌素，具有抗菌活性強、對細胞外膜和組織的穿透力強、有效血藥濃度維持時間長、體內(nèi)代謝穩(wěn)定、血漿蛋白結合率低、可用于肝或腎功能不全者等特點[1-3]，被收錄在世界衛(wèi)生組織(WHO)基本藥物標準清單及《國家基本藥物目錄(2018年版)》，是臨床所需的最有效的藥物。頭孢曲松鈉合成工藝為：7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)與三嗪環(huán)，在三氟化硼/乙腈的催化下，合成7-ACT后，由7-ACT和AE活性酯在單一的乙醇體系或者多元溶劑體系下進行反應生成一分子頭孢曲松鈉與2-巰基苯并噻唑(2-mercaptobenzothiazole，MBT)，副產(chǎn)物MBT直接以固體形式分離后再加入成鹽劑獲得頭孢曲松鈉晶體。而MBT作為頭孢曲松鈉合成過程中的副產(chǎn)物，2016年，WHO國際癌癥研究機構致癌物清單將其列為2A類致癌物，且有文獻報道[4-5]，MBT可刺激皮膚和黏膜，能引起皮炎及難以治療的皮膚潰瘍，可致敏，但是目前尚未見頭孢曲松鈉中2-巰基苯并噻唑檢測方法的相關報道。因此，為了更好地控制頭孢曲松鈉的質(zhì)量，有必要提供一種測量方法，以檢測頭孢曲松鈉中是否含有2-巰基苯并噻唑，從而保證用藥的安全性。

1 儀器與材料

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；MSA6.6S-0CE型百萬分之一天平(德國Sartorius公司)；AB265-S型十萬分之一分析天平(美國Mettler Toledo公司)。

2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌?廣州牌牌生物科技有限公司，批號：PI2-MBT-20181030-01)；頭孢曲松鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號：20181905045、2081905046、2081905047)；乙腈(新藍景化學工業(yè)有限公司，批號：B2119011000)；甲酸(天津光復科技發(fā)展有限公司，批號：20131105)；純化水(屈臣氏集團有限公司，批號：20181204)。所有試劑均為色譜純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent ZORBAX SB-Aq C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為1%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)，等度洗脫；流速為0.5 mL/min；柱溫為25℃；檢測波長為320 nm；進樣量20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液

精密稱取2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌愤m量，加水-乙腈(60:40,V/V)使溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含2-巰基苯并噻唑0.1 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

取頭孢曲松鈉適量，精密稱定，加水-乙腈(60:40,V/V)溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含頭孢曲松鈉10 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液

取頭孢曲松鈉適量，精密稱定，加2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌啡芤喝芙獠⒍肯♂屩瞥擅? mL中約含頭孢曲松鈉10 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下各溶液分別進樣，系統(tǒng)適用性溶液典型色譜圖見圖1?？瞻兹軇┎桓蓴_樣品測定，系統(tǒng)適用性溶液中2-巰基苯并噻唑與相鄰峰之間分離度大于1.5，頭孢曲松鈉中其他特定雜質(zhì)(脫酰頭孢噻肟內(nèi)酯、7-ACA、三嗪環(huán)、AE活性酯、7-ACT、E異構體)均在10 min之前出峰或者在該色譜條件下不出峰，不干擾樣品測定。方法專屬性良好。

2.4 定量限與檢測限

將"2.2.1"項下2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌啡芤阂运?乙腈(60:40,V/V)為溶劑進行稀釋，S/N≈10時的濃度作為定量限濃度，S/N≈3時的濃度作為檢測限濃度。定量限濃度相當于樣品濃度的百分比(%)為0.00005%(0.5 ppm)，檢測限濃度相當于樣品濃度的百分比(%)為0.000015%(0.15 ppm)。

2.5 線性與范圍

在定量限～200%限度濃度范圍內(nèi)選取6個濃度點(定量限溶液、0.02、0.04、0.1、0.14和0.2 μg/mL)進行配液測定。精密量取系列線性溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以溶液濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，進行線性回歸分析。2-巰基苯并噻唑在0.0051～0.2051 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性方程為y=6.4195x-0.0098，r=0.9996(＞0.999)。線性關系圖見圖2。

2.6 準確度試驗

取2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加上述溶劑溶解并定量稀釋制成約0.2 μg/mL的溶液作為雜質(zhì)對照品儲備液。分別取頭孢曲松鈉100 mg，精密稱定，分置于9個10 mL量瓶中，分成3組，分別加入雜質(zhì)對照品儲備液4、5和6 mL，加入溶劑稀釋定容至刻度，制成80%、100%、120% 3個濃度的準確度試驗溶液。分別精密量取上述溶液各20 μL，進樣測定，計算回收率，結果見表1。2-巰基苯并噻唑3個濃度9點回收率在86.3%～102.3%之間，平均回收率為102.8%，RSD=6.0%。

表1 2-巰基苯并噻唑方法學驗證-準確度試驗結果Tab.1 Method validation of MBT-accuracy tests

2.7 重復性與中間精密度試驗

兩位分析員在不同時間，用兩臺不同儀器試驗，每位分析員分別配制6份加標供試品溶液和2份2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌啡芤?。配制方法見?.2”項下對照品溶液與系統(tǒng)適用性溶液(加標供試品溶液)。取配制溶液各20 μL分別進樣分析，計算6份樣品中2-巰基苯并噻唑含量，結果見表2。6份樣品中2-巰基苯并噻唑含量測定結果RSD≤2.0%，12份樣品中2-巰基苯并噻唑含量測定結果RSD≤2.0%。

表2 2-巰基苯并噻唑方法學驗證-重復性與中間精密度試驗結果Tab.2 Method validation of MBT-precision tests

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項下對照品溶液與系統(tǒng)適用性溶液，分別置于0 h、室溫與4℃條件下1、2、4、6、8和12 h后測定，考察對照品溶液與樣品溶液的穩(wěn)定性。結果為4℃條件12 h對照品溶液RSD為1.5%，系統(tǒng)適用性溶液RSD為1.9%；室溫條件12 h對照品溶液RSD為6.5%，系統(tǒng)適用性溶液RSD為10.2%。表明對照品溶液與樣品溶液在4℃條件12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性試驗

分別對柱溫、流速、色譜柱、流動相比例、甲酸比例等條件進行波動，結果見表3。改變柱溫、流速、色譜柱、流動相比例、和甲酸比例，系統(tǒng)適用性溶液分離度均符合要求，表明實驗條件的微小變化對2-巰基苯并噻唑含量測定無影響。

表3 2-巰基苯并噻唑方法學-耐用性試驗結果Tab.3 Method validation of MBT-durability tests

2.10 樣品測定

取3批頭孢曲松鈉樣品，對其2-巰基苯并噻唑含量進行測定，結果見表4。3批樣品中2-巰基苯并噻唑含量均低于定量限。

表4 頭孢曲松鈉中2-巰基苯并噻唑含量測定結果Tab.4 Determination results of MBT in ceftriaxone sodium

3 討論

(1)《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導原則》中MBT屬于已知致癌物質(zhì)，按照Ⅰ類雜質(zhì)控制，Ⅰ類雜質(zhì)控制限度按照PDE或者ADI進行控制。毒性數(shù)據(jù)庫中檢索2-巰基苯并噻唑大鼠口服的TD50為344 mg，本品最大日劑量為4 g，根據(jù)TD50和最大日劑量計算MBT人體可接受限度為84 ppm。根據(jù)EMA關于基因毒性雜質(zhì)限度指南中TTC分段概念，接觸時間≤1個月的允許日吸入量為60 μg，頭孢曲松鈉的最大日劑量為4 g，限度應為15 ppm。因此，制定內(nèi)控標準為不得過10 ppm。

(2)采用水-乙腈(60:40,V/V)、0.1%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)、0.5%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)、1.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)、2.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)篩選流動相，結果采用1.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)作為流動相時MBT的峰型最好，并通過調(diào)節(jié)流速為0.5 mL/min，使MBT與相鄰峰達到基線分離，分離度良好。

(3)頭孢曲松鈉及USP41收載的各特定雜質(zhì)(脫酰頭孢噻肟內(nèi)酯、7-ACA、三嗪環(huán)、AE活性酯、7-ACT、E異構體)在254 nm波長下有最大吸收，MBT在320 nm波長下有最大吸收，為了提高檢測靈敏度以及方法專屬性，實驗選擇320 nm作為檢測波長。

(4)采用流動相1.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)為稀釋劑，MBT的提取回收率較低，分析原因MBT偏堿性，酸度系數(shù)(pKa)約為9.80，酸性條件下易于析出。采用水-乙腈(60:40,V/V)為稀釋劑，2-巰基苯并噻唑3個濃度回收率在86.3%～102.3%之間，表明采用水-乙腈(60:40,V/V)能夠?qū)悠分蠱BT提取較為完全。