刺糖多孢菌高產菌株轉錄組及其多殺菌素合成代謝調控研究

王欣榮 唐智超 曾茂 呂正 翟龍飛 張新宜 劉超蘭 褚以文 王克華 黃挺,*

(1 成都大學藥學院，抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，成都 610106；2 華北制藥集團愛諾有限責任公司，石家莊 052165)

多殺菌素(spinosad)是一類由土壤放線菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa,S.spinosa)經有氧發酵產生的大環內酯類化合物[1-5]。天然的多殺菌素類化合物的母核由一個12元大環內酯與一個鼠李糖和一個福樂糖胺通過糖苷鍵相連構成，根據連接的化學基團的差異而將其主要活性成分分為spinosad A和spinosad D[6-7]。多殺菌素具有新穎的作用機制，它以昆蟲的神經系統為作用靶標，引起害蟲持續的肌肉收縮、顫抖和麻痹，導致害蟲癱瘓死亡，因其獨特的攝食及觸殺毒性，其廣泛的作用譜涵蓋鱗翅目、纓翅目、雙翅目、鞘翅目以及膜翅目等多類害蟲[8-10]。多殺菌素兼具生物農藥的安全性和化學合成農藥的速效性，作為農用抗生素的杰出代表，有望為我國生物農藥產業提供一個新的經濟增長點。但多殺菌素的生產開發一直由美國陶氏益農公司和禮來公司所壟斷，國內研究起步晚，發展水平和產量較低，推廣應用難度大。

本實驗室前期通過對刺糖多孢菌進行多輪理化改造，獲得一株多殺菌素高產突變株SS-168。分子生物學技術手段的發展成熟為刺糖多孢菌的理性改造提供了更可靠的手段。目前，刺糖多孢菌的全基因組測序工作已全部完成[11]，并闡明了多殺菌素的相關生物合成途徑[12-13]。多殺菌素生物合成基因大部分聚集在刺糖多孢菌基因組上約80kb大小的區域中，包含Ⅰ型聚酮合酶的編碼基因、鼠李糖轉移和修飾基因和福樂糖胺的合成及轉移基因。其中負責鼠李糖合成的基因gtt、gdh/kre和epi位于染色體的不同位置[14]。研究表明，通過增加多殺菌素合成相關基因拷貝數，即提高多殺菌素生物合成基因簇內某些基因的表達水平可提高菌株的多殺菌素產量[15]。蔡妹等[16]構建了含有bldD基因和紅霉素強啟動子(PermE)的重組載體pUC-spn-PermE-bldD和遺傳性能穩定的重組菌株S.spinosa-BldD。其結果顯示，重組菌株多殺菌素(A+D)產量相比對照菌株提高了1.35倍。了解刺糖多孢菌在發酵過程中各個時期與多殺菌素生物合成直接相關的基因轉錄水平，并對不同菌株間的差異進行比對分析是刺糖多孢菌的理性改造的重要前提[17]。

本研究通過對刺糖多孢菌野生型菌株SS-WT和高產突變株SS-168在發酵過程中轉錄本的變化進行分析和對比，發現氨基酸生物合成通路發生了顯著變化。通過實時熒光定量PCR驗證了甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路中差異基因的表達，并結合發酵發現部分氨基酸的添加能夠直接提高多殺菌素產量。這些有趣的結果將為進一步提高刺糖多孢菌的多殺菌素產量提供重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

刺糖多孢菌(S.spinosa)SS-WT(SSIA-1802)和高產突變株SS-168(ESA-611)由本研究組保藏[18]。

1.2 培養基及培養條件

1.2.1 培養基[18]

(1)種子培養基：玉米淀粉，1%；酵母浸粉，1.6%；葡萄糖，0.4%；七水硫酸鎂，0.28%；pH 6.7～7.0。

(2)斜面培養基：葡萄糖，0.5%；全脂奶粉，2%；酵母浸粉，0.3%；七水硫酸鎂，0.28%；瓊脂，1.6%。

(3)發酵培養基：葡萄糖，12%；水溶性棉籽餅粉，2.5%；酶水解N-Z-Amine A，0.6%；牛奶蛋白胨，0.5%；酵母浸粉，0.5%；七水硫酸鎂，0.28%；碳酸鈣，0.3%；豆油，1%；pH 7.0。

1.2.2 培養條件

溫度：29℃；相對濕度：35%；轉速：220 r/min。

1.3 試劑與儀器

玉米淀粉、酵母浸粉、全脂奶粉、水溶性棉籽餅粉、酶水解N-Z-Amine A、牛奶蛋白胨等為生化試劑，其余試劑均為國產分析純。

主要使用儀器設備及其型號廠商如下：AE240型精密電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1FD型凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；HPS-160型生化培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發公司；THZ-92A汽浴恒溫振蕩器，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；Legend Micro 17R 高速冷凍離心機，Thermo Scientific 公司。

1.4 刺糖多孢菌發酵樣品制備及測序

使用斜面培養基分別培養刺糖多孢菌SS-WT菌株和SS-168菌株，靜置于29℃培養7 d；取適量孢子接入種子培養基中，置于搖床中220 r/min，29℃培養3 d；再按8%接種量將種子培養液接入發酵培養基中，置于搖床中220 r/min，29℃培養7 d；使用Cell Total RNA Isolation Kit(成都福際生物技術有限公司)提取分別刺糖多孢菌SS-WT菌株和SS-168菌株的總RNA后構建互補DNA文庫，再利用Illumina Hiseq2000測序技術進行測序(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)，每個菌株3個重復[19]。

1.5 轉錄組組裝和差異基因表達分析

組裝方法參考已報道的文獻[19]。利用Stringtie軟件進行轉錄組差異表達分析，再利用Gene Ontology(GO)數據庫分析差異表達的基因功能相似性[20]。此外，再使用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數據庫(http://www.genome.jp/kegg/)和KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)軟件進行差異基因在KEGG通路的富集分析[19]。

1.6 層次聚類分析

為了進一步分析高產刺糖多孢菌菌株的轉錄組數據，應用層次聚類將相似的元素聚集在二叉樹中。再從基因表達譜中提取DEGs的表達數值并應用pheatmap軟件進行層次聚類分析[19]。

1.7 熒光定量PCR

分別提取發酵7 d的刺糖多孢菌SS-WT菌株和SS-168菌株的RNA并逆轉錄成cDNA(RT EasyTMⅡKit, 成都福際生物技術有限公司)，選擇顯著差異的甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路的7個DEGs進行熒光定量PCR驗證。使用Primer Premier 6.0軟件設計的引物列于表1中，引物序列由成都擎科偉業生物技術有限公司合成。20 μL熒光定量PCR反應體系為：2×SYBR green mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，正反向引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL(Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I Kit, 成都福際生物技術有限公司)。熒光定量PCR反應程序為：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火并延伸30 s，共40個循環。溶解曲線參數為: 65℃～95℃，每10 s 上升0.5℃。以Sigma因子sigA作為內參基因[17]，采用2-ΔΔCt法分析比較同一目的基因不同時期的相對表達水平，內參基因和目的基因都做3個復孔。

表1 本研究使用的熒光定量PCR引物Tab.1 Fluorescent quantitative PCR primers used in this study

1.8 氨基酸種類及其添加濃度對多殺菌素產量的影響

參照本實驗室發酵方法[18]，在發酵培養基中分別添加不同濃度的甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸(0，0.2，1，5，10和15 mmol/L)(北京索萊寶科技有限公司)，于發酵第11天取發酵液1.0 mL，加入5 mL無水乙醇，震搖10 min，高速離心得上清液，HPLC分析多殺菌素的含量。

1.9 統計學分析

實驗結果用平均值±標準差(SD)表示。數據均由SPSS 17.0軟件處理，采用單因素方差分析(ANOVA)，組間差異采用t檢驗。P＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 測序與組裝

為了獲得刺糖多孢菌的完整轉錄組，本研究構建了發酵7 d的SS-168及SS-WT樣品組成的cDNA文庫并對其進行測序，共計得到了6個測序文庫。每個組中均生成了超過1.8×107條原始序列。在過濾和清除不可信數據后，各組分別產生了2.79G、4.23G、3.06G、2.85G、2.7G、3.18G數據。Q20的平均百分比和GC含量均超過了97%和67%(表2)。

表2 轉錄組測序和組裝結果Tab.2 Summary of transcriptome analysis

2.2 基因表達水平分析

基因表達以FPKM計算。為了表征刺糖多孢菌SS-168及SS-WT菌株的mRNA的表達模式，使用FPKM值構建了熱圖，以確定兩個菌株的總體轉錄組差異(圖1)。結果顯示在轉錄組中有超過75%的基因表達了(FPKM＞1)，紅色表示高表達基因，藍色表示低表達基因。

2.3 差異基因分析

通過數據預處理，計算這些基因的log2FoldChange和FDR值，以分析刺糖多孢菌SS-168及SS-WT的差異基因。與SS-WT菌株相比，共在SS-168菌株樣本中鑒定出1341個差異基因，包括255個上調基因和1086個下調基因(圖2)。

2.4 差異基因的GO分析和KEGG分析

在提取差異基因的表達值后，對差異基因進行層次聚類分析。GO注釋將這些差異表達基因參與的生物學功能分為2類：生物過程(biological process)和分子功能(molecular function)(圖3)。生物過程主要參與氧化還原過程和脂質代謝。而分子功能方面則包括氧化還原酶活性和輔因子結合及輔酶結合等。GO注釋在不同功能類別中的分布表明了差異基因的實質多樣性(圖3)。

此外，我們確定了由單基因類別代表的生化途徑。差異基因的KEGG注釋表明，它們分布在與丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝(16個基因)、脂肪酸降解(23個基因)、精氨酸/脯氨酸代謝(23個基因)、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝(26個基因)(表3)。在已確定的功能類別中，微生物多樣環境代謝和氨基酸生物合成的比例最高，其次是纈氨酸亮氨酸及異亮氨酸降解、苯丙氨酸代謝和苯丙酮鹽代謝。

表3 差異基因富集的顯著性KEGG通路Tab.3 The KEGG pathways annotated in the transcriptome

2.5 熒光定量PCR分析

為了比較高產菌株SS-168與原始菌株SS-WT中氨基酸生物合成基因的轉錄水平差異，選擇顯著差異的甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路的7個DEGs進行熒光定量PCR檢測。由圖4可知，與原始菌株SS-WT相比，各7個DEGs的轉錄水平在高產菌株SS-168中均顯著上調，高產菌中soxG、soxB和soxD基因的轉錄水平分別比原始菌株提高更為顯著(圖4)。這些比較分析表明，qPCR數據和轉錄組數據的一致率為100%，證實了RNA-seq數據的準確性。

2.6 氨基酸種類及其添加濃度對多殺菌素產量的影響

基于上述轉錄組分析和熒光定量PCR分析，本研究進一步探究了氨基酸及其添加濃度對高產菌株SS-168中多殺菌素產量的影響。如圖5所示，甘氨酸在添加濃度為1 mmol/L時對多殺菌素產量的促進作用最為顯著，添加濃度繼續增加時則會降低多殺菌素產量(圖5A)。而添加低濃度的絲氨酸對多殺菌素產量的提高無明顯效果，只有在添加濃度為15 mmol/L時對多殺菌素產量有顯著促進作用(圖5B)。蘇氨酸的添加濃度為5～15 mmol/L之間時對刺糖多孢菌產多殺菌素產量顯著提高，添加濃度低于5 mmol/L時對多殺菌株產量無明顯的促進作用(圖5C)。通過對添加3種氨基酸的發酵液的HPLC譜圖分析發現，發酵液中多殺菌素的含量顯著提高，詳細譜圖見圖6(甘氨酸)、圖7(絲氨酸)和圖8(蘇氨酸)。

3 討論

刺糖多孢菌SS-168是本實驗室前期篩選獲得的一株多殺菌素產量較高的突變菌株[18]，該菌株基因組中含有23個多殺菌素合成相關基因，包含從丙酸開始的聚酮鏈合成、大環內酯核分子內的交聯反應、鼠李糖糖基的轉移和甲基化以及福樂糖胺糖基的合成和連接的全部基因。除此之外，還含有參與鼠李糖合成的gtt、gdh、kre、epi基因[11]。在SS-168轉錄組樣本中鑒定出1341個差異基因，包括255個上調基因和1086個下調基因。分析認為這些基因表達水平的差異可能影響了高產菌株SS-168合成多殺菌素的能力。

將SS-168與SS-WT轉錄組的GO注釋進行對比。其結果反映SS-168在氧化還原相關基因中具有相對較高的遺傳多樣性水平。這表明在多殺菌素生物合成過程中，相關酶的合成代謝活動旺盛。而KEGG功能分布結果顯示在SS-168菌株中的微生物多樣環境代謝和氨基酸生物合成代謝通路發生顯著性變化。盡管與氨基酸生物合成相比，與微生物多樣環境代謝相關的轉錄物數量要多一些，但微生物多樣環境代謝中的大多數途徑都參與氨基酸生物合成并在合成系統中發揮重要作用。KEGG注釋表明，DEGs主要分布在與丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝通路、脂肪酸降解通路、精氨酸/脯氨酸代謝通路、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路。其中富集在甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路的DEGs最多，因此本研究選擇了該通路做進一步的發酵優化。

伍小穎等[21]考察了18種氨基酸添加對多殺菌素產量的影響,其研究結果發現僅精氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和絲氨酸的添加對多殺菌素產量有顯著的促進作用，組氨酸、谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸的添加對多殺菌素產量變化沒有影響，而另外8種氨基酸的添加會降低多殺菌素產量，但并不清楚這些氨基酸與多殺菌素生物合成的內在聯系。本研究是基于轉錄組數據選擇了具有顯著性差異的甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路，并發現了這些氨基酸添加濃度的變化能影響多殺菌素產量。因此本研究建立的聯合轉錄組學和發酵優化的方法更具有指向性和可操作性。分析認為氨基酸除直接參與多殺菌素合成過程中關鍵酶的合成，還能通過某些代謝途徑轉化成中間代謝產物進入到三羧酸循環中，進一步提供刺糖多孢菌生長及其合成代謝所需的能量，這可能是本研究中部分氨基酸(如甘氨酸和蘇氨酸)能促進多殺菌素產量的原因；而某些氨基酸如低濃度的絲氨酸對多殺菌素的產量提高作用不顯著，可能是由于刺糖多孢菌能夠自身合成該氨基酸或利用轉氨基作用及時補充。此外有些氨基酸也會抑制多殺菌素的合成，可能是因為氨基酸的添加使得培養基的pH或某些理化因素發生變化，影響刺糖多孢菌的生長，進而導致多殺菌素產量降低。

在類似的聚酮類抗生素如紅霉素和阿維菌素等，某些前體物質如油脂類的添加，也能顯著的提升抗生素的發酵產量。例如在紅霉素的發酵過程中添加豆油作為輔助性碳源，在有效避免發酵液中葡萄糖濃度過大引起的葡萄糖效應的同時促進次級代謝產物如紅霉素的合成，其具體原理是菌體分解豆油產生的短鏈脂肪酸與甘油在經過β-氧化和EMP途徑轉化后能夠形成乙酰輔酶A，改變了葡萄糖濃度過高時的菌體生長代謝的代謝流向，從而使紅霉素發酵產量提高[22]。此外，徐瑤[23]發現在阿維菌素的次級代謝產物的合成代謝階段添加豆油可以提高阿維菌素的發酵產量，且添加濃度僅在0.5%～1.5%范圍內與阿維菌素的發酵產量的提高呈現正相關。這一點在其他的研究發現中也得到了例證，如馬坤[24]在多殺菌素的發酵優化中發現菜籽油的添加能增強脂肪酶基因及多殺菌素合成基因的表達豐度，促進多殺菌素的合成。油脂代謝可以提供短鏈脂肪酸作為大環內酯抗生素合成單元，提高產物合成，本研究中的突變株可以更多地利用特殊氨基酸提高多殺菌素的合成，這些氨基酸可能也是作為短鏈脂肪酸的前體發揮作用。相較于傳統的發酵優化，有選擇性地優化某一類前體物質為微生物來源的抗生素合成提供了一種高效可行的發酵優化策略。

4 結論

本研究構建了刺糖多孢菌高產突變株SS-168及野生型SS-WT轉錄組譜。并生成了一個差異基因庫，通過對差異基因的GO和KEGG的功能分類確定了多種生物過程和信號通路，包括甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝通路。實時熒光定量PCR驗證了該通路中部分DEGs的轉錄水平，并通過發酵培養基優化發現甘氨酸與蘇氨酸的添加能顯著提高多殺菌素產量，而添加低濃度的絲氨酸對多殺菌素產量變化無明顯效果。本研究為改良刺糖多孢菌菌株和優化發酵工藝提供重要的理論基礎和參考依據。