基于網絡藥理學的蔥白提取物治療非酒精性脂肪性肝病的機制研究和驗證*

劉云，郭潔，張曼玲，時昭紅

（1.湖北中醫藥大學，武漢 430000；2.湖北中醫藥大學附屬武漢市第一醫院，武漢 430000）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝臟損傷，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征，包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化[1]。NAFLD 除直接或間接通過促進并存的其他肝病進展，導致肝臟衰竭和肝細胞癌（HCC）外，還參與2 型糖尿病及動脈硬化的發病，是導致慢性肝病的重要原因之一[2]。

本課題組在近10 年的臨床診療中，借張仲景“旋覆花湯”（方藥組成：旋覆花、蔥白、茜草）治療肝著通陽通絡之意，大劑量運用具有通陽作用的蔥白汁對NAFLD 進行治療，療效顯著。同時課題組進一步與湖北中醫藥大學藥學院共同研發出蔥白提取物（蔥白有效部位的主要成分為二烯丙基硫醚、兒茶素等）[3]，進行長期大樣本臨床研究[4]，結果表明蔥白提取物對脂肪肝患者療效顯著，且蔥白提取物療效優于脂必妥。基于此，本研究運用網絡藥理學方法對蔥白進行進一步的挖掘與數據分析，篩選并預測出治療NAFLD 相關性最強的化合物及分子靶點，進而運用小分子RNA 干擾（RNAi）技術在動物實驗中進行驗證。

1 材料

1.1 動物及細胞系 SPF 級SD 雄性大鼠48 只，6～8 周齡，體質量（200±20）g，由湖北省疾病控制中心提供，合格證編號：SCXK（鄂）2008-0005。293T 細胞系，購于賽默飛公司。

1.2 藥物與試劑 蔥白提取物來自于華夏小蔥根莖，由武漢市第一醫院藥劑研究室提取，為褐色粉末狀，批號：20110902，以適量植物油調配成懸混液，控制濃度為5 g/L；大鼠高脂飼料組成為：72.1%標準大鼠飼料，2%膽固醇（采購于國藥集團化學試劑有限公司），10%豬油，5%蔗糖，0.5%脫氧膽酸鈉（采購于國藥集團化學試劑有限公司），0.2%甲硫氧嘧啶（50 mg/片，采購于北京燕京藥業有限公司）；由武漢巴菲爾生物有限公司提供空載腺病毒及過氧化物酶體增生物激活受體γ 共激活因子-1α（PGC-1α）RNAi 腺病毒，滴度為109 pfu/mL。

1.3 主要儀器 Sigma30 高速低溫離心機（法國，Sigma 公司），HITACHI7160 全自動生化檢測儀（日本，HITACHI 公司），微量移液器（Eppendorf 公司），電泳儀電源（型號：DYY-7C，北京六一儀器廠），垂直電泳槽（型號：DYCZ-24DN，北京六一儀器廠），電轉儀（型號：DYCZ-40，北京六一儀器廠），水平搖床（型號：TS-1，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），pH 計（型號：LP115，德國Metter-Toledo GmbH公司），電子天平（型號：CPA，北京賽多利斯儀器系統有限公司）；P4000 高效液相色譜儀（美國TSP 公司），二極管陳列檢測器（型號：UV6000，美國TSP 公司），實時定量-聚合酶鏈反應（RT-PCR）儀（型號：ABI7500，美國Thermo 公司）。

2 方法

2.1 蔥白有效化學成分篩選 利用中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）檢索“蔥白”所含全部化合物，同時以口服生物利用度（OD）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為閾值進行篩選。

2.2 蔥白有效成分相關基因靶點預測 利用TCMSP 網絡數據庫，下載蔥白所含化合物相關基因靶點，利用Perl 語言軟件（5.28 版）進行蔥白有效化學成分相關靶點篩選。

2.3 NAFLD 基因靶點獲取 登錄GeneCards 網絡數據庫，檢索“NAFLD”疾病基因并下載。

2.4 蔥白與NAFLD 的共同基因靶點獲取 通過R語言軟件（4.0.0 版）將“蔥白有效成分相關基因靶點”與“NAFLD 基因靶點”進行映射，得到藥物與疾病相互作用的共同靶點并通過Venn 圖表現。

2.5 “活性成分-靶點-疾病”網絡圖及蛋白互作圖構建 將上述步驟所得到的數據輸入Cytoscape 軟件（3.8.0 版）構建“活性成分-靶點-疾病”網絡圖，同時將共同靶基因上傳至String 網絡數據平臺，構建出蛋白互作（PPI）網絡圖。

2.6 生物功能與通路富集分析 通過R 語言軟件對蔥白治療NAFLD 疾病的預測靶點進行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析。

2.7 采用動物實驗驗證網絡藥理學結果 將48 只SD 雄性大鼠分為6 組，即空白組、模型組、蔥白組、空轉組、轉染組、轉染加蔥白組，除空白組外，其余5 組大鼠均采用高脂飼料喂養法造模，喂養12 周后造模成功，繼續給予高脂飼料喂養，自由進食飲水。空白組及模型組腹腔注射生理鹽水1 mL 及生理鹽水灌胃，每日1 次；蔥白組腹腔注射生理鹽水1 mL及蔥白灌胃，每日1 次；轉染組腹腔注射PGC-1αRNAi腺病毒1 mL 及生理鹽水灌胃，每日1 次；空轉組腹腔注射空載體病毒1 mL 及生理鹽水灌胃，每日1 次；轉染蔥白組腹腔注射PGC-1α RNAi 腺病毒1 mL及蔥白灌胃，每日1 次。各組操作時間固定于每日下午，共持續4 周。藥物處理4 周后處死大鼠，取出肝臟，進行蘇木精-伊紅（HE）及油紅O 染色，蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測肝臟組織過氧化物酶體增殖物受體γ（PPARG）、PPARG 輔助活化因子A（PPARGC1A）蛋白表達，RT-PCR 法檢測肝臟組織PPARGC1A mRNA 表達。

2.8 統計學分析 使用SPSS 22.0 軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 蔥白和NAFLD 的網絡藥理學研究

3.1.1 蔥白的有效成分及作用靶點 通過TCMSP網絡數據平臺，以OB＞30%、DL＞0.18 為篩選標準，共篩選出化合物7 個。見表1。

表1 蔥白有效活性成分

3.1.2 蔥白和NAFLD 基因靶點的預測及可視化分析 通過GeenCards 數據庫得到NAFLD 相關靶點1 024 個，通過R 語言軟件得到蔥白有效成分對應基因靶點36 個，并通過R 語言軟件繪制Venn 圖，得到共同靶點16 個，見圖1。將上述16 個共同靶點通過Cytoscape 3.8.0 軟件構建蔥白藥物治療NAFLD 的“活性成分-靶點-疾病”可視化網絡圖，見圖2。

圖1 蔥白與NAFLD 的共同作用靶點Venn 圖

圖2 “活性成分-靶點-疾病”可視化網絡圖

3.1.3 蔥白治療NAFLD 的PPI 網絡分析 將蔥白及NAFLD 的16 個共同蛋白靶點上傳至String 網絡數據平臺，設置置信度＞0.4，所得結果中存在1 個游離靶點蛋白，另外15 個靶點蛋白可形成PPI 網絡圖，其中每個節點代表蛋白靶點，連接線代表蛋白之間的作用關系。同時運用R 語言軟件，對各個靶點間的相關性進行統計，見圖3。

圖3 蔥白治療NAFLD 相關靶點PPI 網絡圖及計數統計

3.1.4 蔥白治療NAFLD 的GO 功能富集分析 通過R 語言軟件對16 個靶點蛋白進行GO 分析，設置P 值為0.05，共得到67 個功能分析條目，見圖4，圖中展示了前20 位功能調控條目，涉及較多的為雌激素受體結合、核受體活性、轉錄因子活性及特異性DNA 結合直接配體調控序列、類固醇激素受體、核受體轉錄共激活活性、谷胱甘肽及寡肽結合等。3.1.5 KEGG 通路富集分析 通過R 語言軟件對16 個靶點蛋白進行KEGG 通路富集分析，共得到114 條通路，見表2，表中列舉了前30 位信號通路名稱，其中涉及NAFLD 的相關信號通路包括流體剪切應力和動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥的AGERAGE 信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路、核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路、細胞凋亡等。

表2 KEGG 通路富集

圖4 GO 富集分析柱狀圖及點狀圖

3.2 蔥白提取物治療NAFLD 的實驗驗證

3.2.1 PPARGC1A RNAi 腺病毒及空載體腺病毒包裝與轉染率實驗 為驗證PPPARGC1A RNAi 腺病毒構建成功，預先在正常大鼠中進行腺病毒轉染驗證。應用線性化的pBSilence1.1 質粒表達載體構建干擾質粒，對干擾質粒進行有效性篩選后亞克隆，在293T細胞系中擴增，濃縮病毒滴度值至109 pfu/mL 備用。應用RT-PCR 法驗證病毒可以knock-down 大鼠轉錄因子PPARGC1A 表達，與空白組相比，空白加轉染組大鼠PPARGC1A mRNA 的表達降低（P＜0.01）。見圖5。

圖5 PPARGC1A RNAi 腺病毒對正常大鼠肝臟PPARGC1A mRNA 表達的影響（±s，n=8）

隨后在實驗各組大鼠中進行PGC-1α RNAi 腺病毒轉染驗證，與空轉組比較，轉染組PPARGC1A mRNA 的表達水平降低（P＜0.01），證實轉染成功。與空白組比較，模型組PGC-1α mRNA 的表達水平降低（P＜0.01），證實NAFLD 的發生發展過程與PPARGC1A失活相關。與模型組比較，蔥白組PPARGC1A mRNA的表達水平增加（P＜0.01），轉染加蔥白組差異無統計學意義。見圖6。

圖6 PPARGC1A RNAi 腺病毒實驗各組大鼠肝臟PPARGC1A mRNA 表達的影響（±s，n=8）

3.2.2 蔥白提取物對NAFLD 大鼠肝臟PPARG、PPARGC1A 蛋白合成的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝臟的PPARG、PPARGC1A 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，蔥白組大鼠肝臟的PPARG、PPARGC1A 蛋白表達升高（P＜0.01）；與空轉組比較，轉染組大鼠PPARG、PPARGC1A 蛋白表達降低（P＜0.01）。見圖7。

圖7 大鼠肝臟PPARG、PPARGC1A 蛋白的表達水平條帶圖及灰度統計圖（±s，n=8）

3.2.3 蔥白提取物對NAFLD 大鼠肝臟組織病理學影響 從肝臟外觀來看，空白組大鼠肝臟色澤鮮紅，表面光滑，邊緣銳利；蔥白組接近空白組，無明顯油膩狀，指壓有彈性，體積大小接近空白組；其余4 組大鼠肝臟肉眼觀察可見體積增大，顏色淺黃，質軟，邊緣變鈍，表面有油膩感。

從HE 染色結果來看，空白組細胞基本無異常變化，未見明顯脂滴空泡；模型組、空轉組、轉染組及轉染加蔥白組細胞胞漿內充滿大小不等的脂滴空泡，部分肝細胞核被擠到一邊，細胞腫脹；蔥白組細胞內脂滴少于模型組。

從油紅O 染色結果來看，空白組肝細胞邊緣清晰，細胞核大，細胞內未見紅色脂滴聚集；模型組、空轉組及轉染組肝細胞邊緣欠清晰，細胞間結合欠緊密，細胞胞漿內充滿大小不等的紅色脂滴，細胞發生明顯腫脹；蔥白組肝細胞內橘紅色脂滴數量少于模型組，轉染加蔥白組肝細胞內紅色脂滴數量介于模型組和蔥白組之間。

通過肝細胞氣球樣變、小葉內炎癥及肝細胞脂肪變3 個方面進行NAS 評分，結果顯示與空白組大鼠相比，高脂飲食造成的模型組大鼠的NAS 評分升高（P＜0.01）；與模型組相比，經蔥白提取物處理后的蔥白組大鼠肝臟NAS 評分有所改善（P＜0.01）；空轉組、轉染組、轉染加蔥白組未見統計學差異。見圖8、圖9。

圖8 各組大鼠肝臟組織HE 及油紅O 染色結果

圖9 各組大鼠肝臟NAS 評分（±s，n=8）

4 討論

中醫藥治療NAFLD 從整體出發，根據患者體質結合疾病發病原因與規律，全面調節患者氣血陰陽失衡狀態。無論辨證論治、專法專方治療，以及名醫經驗、中西醫結合療法、中醫多途徑、多方法治療等，在控制病因、降脂、降糖、促進肝內脂肪消退、減少肝細胞壞死、炎癥和纖維化等方面均取得了獨特的療效優勢。但中醫治療NAFLD 多針對其痰、瘀、濁的證候辨證施治，對病機的研究多偏重于痰濕瘀血阻滯，而對陽氣不通的病機認識不夠，故仍有部分NAFLD 患者臨床療效欠佳。對于這部分患者，課題組大劑量運用具有通陽作用的蔥白汁進行治療，療效顯著。

網絡藥理學信息技術是近幾年興起的新型數據分析技術，本研究應用此項技術，運用數據挖掘的方法并結合動物實驗，證明蔥白提取物治療NAFLD 的科學性與可行性。本研究篩選得到蔥白治療NAFLD 的兩個有效成分，山奈酚（kaempferol）與15 個基因靶點對應，兒茶素（catechin）與1 個基因靶點對應。其中kaempferol 是蔥白發揮治療作用的主要有效成分之一，研究證實kaempferol 可改善肥胖大鼠糖脂代謝，降低肥胖大鼠血糖及血脂水平[5]。

同時，GO 功能富集分析顯示，蔥白治療NAFLD主要涉及雌激素受體結合、核受體活性、轉錄因子活性、特異性DNA 結合直接配體調控序列及核受體轉錄共激活活性等生物過程。核受體包含48 個轉錄因子家族[6]，其中過氧化物酶體增殖物受體（PPARs）是核受體超家族之一，在調節肝臟糖脂代謝方面起著重要的調控作用。PPARG 是PPARs 中的一員，在脂肪組織中高度表達，可加速脂肪酸的氧化和分解，并能增加胰島素敏感性，降低血糖、血脂水平[7]。目前，PPARG 受體激活劑羅格列酮在臨床上運用廣泛，實驗證明PPARG 上調可改善肝臟脂肪性病變[8]。通過KEGG通路富集分析，顯示炎性因子通路在NAFLD疾病發展過程中占有重要地位。同時在肝臟中PPARG可誘導M1 型巨噬細胞向M2 型巨噬細胞轉化，發揮免疫抑制型巨噬細胞作用，減少炎性細胞因子分泌，改善肝臟免疫炎性反應[9]。

通過PPI 網絡圖發現PPARGC1A 與PPARG 存在密切聯系，PPARGC1A 是一種可介導能量代謝的核受體輔助激活因子，通過停靠轉錄因子，如細胞核呼吸因子-1（NRF-1）、肝細胞核因子-4α（HNF-4α）以及大多數核受體超家族成員，以不同的方式與其發生分子對接，進而調控其下游一系列基因表達，在機體的線粒體生物合成、肝糖異生、脂肪酸β氧化及氧化應激等一系列能量代謝過程中發揮重要作用，PPARGC1A 基因失活使PPARG 無法激活，減少脂肪酸β 氧化酶的轉錄活性[10]。同時，下調肉毒堿棕櫚酰基轉移酶（CPT）、核呼吸因子（NRF）、線粒體轉錄因子A（mtTFA）的轉錄活性，減少線粒體β氧化，降低線粒體對葡萄糖的轉化，導致脂肪酸在肝細胞堆積[11]。KEGG 通路富集分析顯示PI3K/Akt信號通路在NAFLD 糖脂代謝紊亂中具有重要作用，病理情況下Akt 磷酸化異常，導致肝細胞胰島素抵抗，不能有效抑制肝糖原輸出，PPARGC1A 表達上調可維持Akt 正常酪氨酸磷酸化，增加肝臟對胰島素的敏感性[12]。

本次實驗證實了PPARGC1A 與PPARG 的相關性以及蔥白提取物治療NAFLD 的可行性。因此，通過運用網絡藥理學的分析方法，可以預測“活性成分-靶點-疾病”的相互作用關系，為探索具有復雜成分的中藥治療NAFLD 的作用機制提供新的研究方法。