腹腔注射多氯聯(lián)苯118 的雄性大鼠甲狀腺功能變化觀察及其機制探討

朱曉霞，許文立，段宇

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南京 210029

多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）是一種人工合成的持久性有機環(huán)境污染物，曾作為冷卻劑、熱載體和絕緣油等廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中。PCBs的化學穩(wěn)定性高、難以分解，目前普遍存在于水、土壤和空氣中［1］。PCBs 的高親脂性導致其在生物體內(nèi)積聚，并沿著食物鏈進一步富集，對動物和人類造成一系列不良影響，如致癌、認知和行為異常、致畸和內(nèi)分泌代謝紊亂等［2-3］。PCBs 對甲狀腺組織高度親和，可直接沉積在甲狀腺組織中。長期暴露于富含PCBs 環(huán)境中的人群、海洋生物或野生哺乳類動物甲狀腺組織中均可檢測出PCBs，并出現(xiàn)甲狀腺分泌功能下降及甲狀腺組織纖維化［4-5］。甲狀腺功能異常已成為糖尿病、肥胖、脂質(zhì)異常等多種衰老相關性疾病的獨立危險因素［6-8］。我們前期研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，持續(xù)低劑量PCB118 暴露可導致大鼠甲狀腺功能異常，甲狀腺組織間質(zhì)纖維化、炎癥浸潤，但其發(fā)生機制尚未明確。2021 年6 月起，我們觀察了PCB118 腹腔注射后Wistar 大鼠甲狀腺功能變化，評估了甲狀腺組織的衰老程度，檢測了衰老基因、SASP、線粒體動力學因子的表達，為進一步揭示PCB118 引發(fā)甲狀腺功能異常的作用機制提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 24 只8 周齡SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（225 ± 20）g，購于Vital River 公司（中國北京），飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學動物實驗中心，飼養(yǎng)條件為相對濕度50%～60%，環(huán)境溫度20 ℃～25 ℃，明暗周期12 h，自由攝食及飲水。純度100%的PCB118（No. 31508-00-6）購自美國Ac‐cuStandard 公司，溶解于玉米油（C8267，美國Sigma公司）中，避光常溫保存。ELISA 試劑盒購自中國麥莎公司，細胞衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色試劑盒購自中國碧云天，總RNA 提取試劑盒購自美國Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix Kit 購自美國TaKaRa 公司，、SYBR-Green PCR 試劑盒購自中國諾維贊公司，StepOnePlus 實時定量PCR 儀購自美國AppliedBiosystems 公司，qRTPCR 引物由上海英俊公司合成。

1.2 大鼠分組及PCB118 腹腔注射方法 24 只大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后隨機分為A、B、C 及對照組4組，每組6 只。A、B 及C 組大鼠分別用10、100 和1 000 μg/（kg·d）的PCB118 腹腔注射，1 天/次，一周5 次，共注射13 周。對照組用等容積玉米油腹腔注射，1 天/次，一周5 次，共注射13 周。造模期間大鼠無行為異常，各組大鼠體質(zhì)量變化無統(tǒng)計學差異。

1.3 各組大鼠甲狀腺功能指標觀察 造模結束時處死各組大鼠，心臟取血并分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆茫捎肊LISA 試劑盒測定各組大鼠血清游離甲狀腺素（FT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）及促甲狀腺激素（TSH），所有操作均嚴格按照使用說明書進行。留空白孔調(diào)零，使用酶標儀測量標準品及樣品的光密度OD 值。根據(jù)標準品濃度及吸光度值建立標準曲線后計算樣品的濃度。試驗重復3 次，取平均值。

1.4 各組大鼠甲狀腺組織衰老情況觀察 采用SA-β-gal染色評估甲狀腺組織衰老情況。處死各組大鼠后取新鮮甲狀腺組織，冰凍切片，使用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒對組織的冰凍切片進行SA-β-gal 染色，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。顯微鏡下觀察各組大鼠甲狀腺組織SA-β-gal表達情況。SA-β-gal染色以X-Gal為底物，在衰老特異性的SA-β-gal 催化下會生成深藍色產(chǎn)物，光學顯微鏡下可觀察到表達SA-β-gal的組織變?yōu)樗{色。對各組大鼠甲狀腺組織SA-β-gal 染色情況進行計量分析，測算各組SA-β-gal 染色陽性率。實驗重復3 次，取平均值。

1.5 各組大鼠甲狀腺組織衰老基因、衰老相關分泌表型中的部分因子及線粒體動力學相關蛋白的基因表達檢測 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測各組大鼠甲狀腺組織衰老基因（p16、p21、p53）、衰老相關分泌表型標志物［白細胞介素-1α（IL-1α）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素-6（IL-6）、基質(zhì)金屬肽酶13（MMP13）］mRNA、線粒體動力學相關蛋白［線粒體自噬調(diào)節(jié)因子PTEN誘導激酶1（PINK1）、線粒體動力相關蛋白1（DNM1L）、線粒體融合蛋白1（MFN1）、線粒體融合蛋白2（MFN2）mRNA。取各組甲狀腺組織，根據(jù)說明書用總RNA 提取試劑盒提取大鼠甲狀腺組織的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。使用SYBR-Green PCR 試劑盒在Ste‐pOnePlus 系統(tǒng)上進行qRT-PCR。以β-actin 作內(nèi)參，β-actin 上游引物5'-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3'，下游引物5'-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3；p21 上游引物5'- ATGTCCGATCCTGGTGATGTCC‐GA-3'，下游引物 5'- TCAGGGCTTTCTCTTG‐CAGAAGAC-3；p16 上游引物5'- TACCCCGATA‐CAGGTGATGA-3'，下游引物5'-TACCGCAAATACC‐GCACGA-3；p53 上游引物5'-GTCGGCTCCGAC‐TATACCACTATC-3'，下游引物 5'-CTCTCTTTG‐CACTCCCTGGGG-3；IL-6 上游引物5'-GTCAACTC‐CATCTGCCCTTC-3'，下游引物 5'-TGTGGGTGG‐TATCCTCTGTG-3；TNF- α 上游引物 5'-CATCC‐GTTCTCTACCCAGCC-3'，下游引物 5'-AATTCT‐GAGCCCGGAGTTGG-3；IL-1α 上游引物5'-AAGA‐CAAGCCTGTGTTGCTGAAGG-3'，下游引物 5'-TCCCAGAAGAAAATGAGGTCGGTC-3；MMP13 上游引物5'-TGATGGGCCTTCTGGTCTTCT-3'，下游引物5'-AGGTCTCGGGATGGATGCT-3；PINK1 上游引物5'-AATGCCGCTGTGTATGAAGC-3'，下游引物5'-CTCCCCATCTGCTCCCTTT-3；DNM1L 上游引物5'-TCCCTAAACTCCATGATGCCATA-3'，下游引物5'-CCACAGGCATCAGCAAAGTC-3；MFN1 上游引物5'-CCTTGTACATCGATTCCTGGGTTC-3'，下游引物5'-CCTGGGCTGCATTATCTGGTG-3；MFN2 上游引物5'-TCAAGCGCCAGTTTGTGGAG-3'，下游引物5'-CACAGATGAGCAAATGTCCCAGA-3。 以 2-ΔΔCT代表目的基因的相對表達量。實驗重復3 次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。應用Shapiro-Wilk 法檢驗計量資料的正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用Tukey 法。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清FT4、FT3 及TSH 水平比較 各組大血清FT4、FT3及TSH水平比較見表1。

表1 各組大鼠血清FT4、FT3及TSH水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清FT4、FT3及TSH水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與A 組比較，#P < 0.05；與B 組比較，&P<0.05。

TSH（mIU/L）0.70±0.11 0.79±0.10*0.84±0.07*0.62±0.04組別A組B組C組對照組FT3（pmol/L）18.46±0.63 17.71±0.51*16.67±0.47*#&18.79±0.61 FT4（pmol/L）141.96±2.13 131.12±3.86*#118.80±9.51*#&146.55±3.06

2.2 各組大鼠甲狀腺組織SA-β-gal 染色陽性率比較 A、B、C及對照組大鼠甲狀腺組織SA-β-gal染色陽性率分別為15.46%±4.81%、15.84%±9.15%、31.04%±7.61%、4.14%±2.91%。與對照組比較，A、B、C組大鼠甲狀腺組織SA-β-gal染色陽性率升高（P均<0.05）；與A、B 組比較，C 組大鼠甲狀腺組織SA-β-gal染色陽性率高（P<0.05）。

2.3 各組大鼠甲狀腺組織p16、p21及p53基因相對表達量比較 各組大鼠甲狀腺組織p16、p21 及p53基因相對表達量比較見表2。

表2 各組大鼠甲狀腺p16、p21及p53基因相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠甲狀腺p16、p21及p53基因相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別A組B組C組對照組p53 1.33±0.41 1.29±0.32 1.32±0.46 1.01±0.12 p16 1.65±0.31 2.28±0.60*2.34±0.57*1.04±0.32 p21 1.75±0.34 2.02±0.66*2.24±0.32*1.00±0.06

2.4 各組大鼠甲狀腺組織IL-6、TNFα、MMP13及IL-1α的基因相對表達量比較 各組大鼠甲狀腺組織IL-6、TNFα、MMP13及IL-1α基因相對表達量比較見表3。

表3 各組大鼠甲狀腺組織IL-6、TNFα、MMP13及IL-1α基因相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠甲狀腺組織IL-6、TNFα、MMP13及IL-1α基因相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與B組比較，&P<0.05。

組別A組B組C組對照組IL-1α mRNA 1.19±0.46 1.57±1.56 1.16±0.87 1.01±0.20 IL-6 mRNA 3.62±0.67*3.76±1.07*4.06±0.94*1.01±0.17 TNFα mRNA 2.40±0.31 3.06±1.27*0.74±0.17&1.01±0.19 MMP13 mRNA 3.22±0.66*3.39±0.75*4.44±1.04*1.04±0.32

2.5 各組大鼠甲狀腺組織PINK1 mRNA、DNM1L mRNA、MFN1 mRNA及MFN2 mRNA相對表達量比較 各組大鼠甲狀腺組織PINK1 mRNA、DNM1L mRNA、MFN1 mRNA及MFN2 mRNA相對表達量比較見表4。

表4 各組大鼠甲狀腺組織PINK1 mRNA、DNM1L mRNA、MFN1 mRNA及MFN2 mRNA相對表達量比較（±s）

表4 各組大鼠甲狀腺組織PINK1 mRNA、DNM1L mRNA、MFN1 mRNA及MFN2 mRNA相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與A 組比較，#P < 0.05；與B 組比較，&P<0.05。

MFN2mRNA 1.54±0.27 1.26±0.33 0.40±0.22*#&1.01±0.17組別A組B組C組對照組PINK1mRNA 2.50±0.52 2.81±1.24*1.67±0.56 1.05±0.25 DNM1LmRNA 1.89±0.24*1.43±0.11*0.52±0.11*#&1.01±0.16 MFN1mRNA 1.96±0.29*1.93±0.39*0.63±0.13#&1.02±0.24

3 討論

PCBs 是一種在環(huán)境中廣泛存在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，它可以通過食物持久蓄積于生物體內(nèi)，已被證明可造成動物和人體神經(jīng)、免疫、生殖、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多組織、多系統(tǒng)損傷［11］。PCBs 可影響人體淋巴細胞的端粒酶活性，加速端粒縮短。端粒是染色體末端高度重復的核苷酸序列，可保護染色體免受侵蝕，對保持基因組穩(wěn)定性至關重要［12］。隨機體老化，端粒酶活性會降低、端粒縮短。由此推測PCBs可能會加速機體衰老，但目前關于PCBs 是否促進甲狀腺衰老的研究尚缺乏。PCB118 在我國長三角地區(qū)廣泛存在，常作為評估環(huán)境中多氯聯(lián)苯總量的指標［13］，因此本研究選用PCB118 作為PCBs 同系物的代表，研究PCBs 能否引起大鼠甲狀腺衰老及其潛在機制。

衰老是一個普遍的、內(nèi)在的和復雜的過程，其特征是組織和器官功能逐漸喪失［14］。流行病學調(diào)查［7］顯示在老年人群中的隨著年齡增大其甲狀腺分泌功能降低，表現(xiàn)為血清中FT4 及FT3 水平降低、TSH 升高。本研究中我們檢測了對照組及PCB118 暴露組的大鼠血清甲狀腺功能，結果顯示暴露組大鼠出現(xiàn)明顯的甲狀腺功能異常。血清FT3、FT4 水平隨著PCB118 劑量的增加而下降，TSH水平則隨著PCB118 劑量的增加而上升，這與老化進程中甲狀腺功能的變化相一致，提示PCB118 暴露導致了大鼠甲狀腺功能降低，這可能是甲狀腺早衰引起的。

細胞衰老是脊椎動物和人類衰老的標志，衰老細胞的存在及累積可造成組織器官損傷，導致患心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等疾病的風險增加［15］。衰老反應引起細胞表型的顯著變化，包括細胞分裂潛能的不可逆性尚失、細胞凋亡抗性的發(fā)生以及基因表達模式的改變［16］，這些變化可以被一些標記物識別。SA-β-gal是用于具體識別衰老細胞的第一個標記。SA-β-gal一直是用于在體外或體內(nèi)識別衰老細胞的最廣泛使用的可靠生物標志物，它的活性通常通過用顯色底物X-gal 進行原位染色來確定［17］。本研究中SA-β-gal 染色顯示，對照組可看到稀疏散在的被染成藍色的甲狀腺細胞、且染色很淺，而在PCB118暴露組大鼠甲狀腺組織SA-β-gal活性增強、催化生成的深藍色產(chǎn)物明顯增多，在光學顯微鏡下表現(xiàn)為藍染強度增強、面積增大，并且隨著PCB118 濃度的增加這種變化越來越明顯，C 組可觀察到藍色最深、且藍染面積最大。同時我們對其進行了計量分析也發(fā)現(xiàn)PCB118 處理組的SA-β-gal 染色陽性占比明顯高于對照組，C 組中SA-β-gal 染色陽性率顯著高于A、B 組及對照組，提示PC118 暴露可致大鼠甲狀腺組織內(nèi)衰老細胞累積，且衰老細胞隨著PC118 暴露濃度的增高而進一步增多。

衰老細胞決定性特征之一是穩(wěn)定的細胞周期停滯，它的基因表達譜也發(fā)生極端變化，尤其是與細胞周期抑制劑或激活劑相關的基因，如p21、p16的過度表達。p21 和p16 是p53 和RB 控制的腫瘤抑制通路的組成部分，其中p21 基因被認為是唯一已知的具有促衰老功能的介質(zhì)，p21 結合并調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2），導致細胞的G1周期停滯和衰老。p21 的作用主要在于衰老的啟動，而p16 則可保持持久的生長停止。在本研究中，p21、p16 相對表達量隨PCB118 暴露濃度增加均顯著上升。p21、p16、p53 通常以協(xié)同或相互關聯(lián)的方式起作用以阻斷細胞周期并實施衰老程序，但在不同細胞類型或物種中它們發(fā)揮的作用不同。高表達的p21 或p16 可誘導人成纖維細胞周期停滯，p53 在小鼠胚胎成纖維細胞的衰老中發(fā)揮重要作用［18］。本研究結果顯示，在PCB118 誘導大鼠甲狀腺組織衰老的過程中p16、p21 發(fā)揮重要的作用。

以往研究認為，細胞衰老是一種靜態(tài)的細胞命運。最新研究發(fā)現(xiàn)，衰老是一個動態(tài)的多步驟過程。盡管最初的衰老誘導信號足以啟動細胞周期退出，但這僅僅是衰老過程的早期步驟。衰老細胞逐漸重塑染色質(zhì)，形成獨特的分泌蛋白譜，包括多種促炎細胞因子、生長因子和細胞外基質(zhì)降解蛋白，其特征是持續(xù)的促炎性表型，稱為衰老相關分泌表型，進入“完全衰老”的第二步［19］。盡管它們的生長停滯，衰老細胞仍具有代謝活性并且可以影響它們的微環(huán)境，衰老相關分泌表型能在鄰近的年輕細胞中誘導衰老，促進炎癥和功能障礙向鄰近細胞的傳播［15］。衰老相關分泌表型已被證實與老齡化和年齡相關疾病密切相關。低水平慢性炎癥（也稱為“無菌炎癥”）是許多年齡相關疾病的病理學基礎。消除衰老細胞可以降低老年小鼠脂肪、腎臟和骨骼肌中的促炎細胞因子水平，如IL-6、IL-1α 和TNF-α［15］。其中IL-6 被認為是衰老相關分泌表型的核心之一，它在多種類型的衰老組織或細胞中表達上升，包括衰老的垂體組織及甲狀腺細胞等［20］。MMP13 則是一種重要的細胞外基質(zhì)降解蛋白。我們檢測了IL-6、TNFα、MMP13、IL-1α 的基因表達水平，qRT-PCR 結果顯示IL-6 在PCB118 暴露組中mRNA 相對表達量均顯著上升，MMP13、TNFα 在B 組也顯著上升，而IL-1α 在各組之間無顯著差異。這些結果表明暴露組甲狀腺處于衰老相關變化的風險中。

線粒體是機體重要的細胞器，在調(diào)節(jié)能量和新陳代謝穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用。長期以來線粒體代謝紊亂和ROS 產(chǎn)生在衰老中的作用已經(jīng)得到廣泛證實。近年有研究結果揭示了線粒體膜動力學受損和線粒體質(zhì)量控制機制在衰老中的作用［21］。線粒體膜動力學通過不斷交替進行的融合—裂變來調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量、形態(tài)和分布，以確保線粒體網(wǎng)絡適應細胞生物能量需求。線粒體融合可使細胞器拉長，擴大線粒體網(wǎng)絡及其互連性，重新分配能量，改善鈣穩(wěn)態(tài)和ATP 合成；裂變則將功能受損的組件分離出來以待線粒體自噬將其進一步去除。線粒體自噬是一種通過自噬機制選擇性清除受損或功能失調(diào)的線粒體的過程，其功能是維持線粒體質(zhì)量控制和體內(nèi)平衡。線粒體自噬對細胞活動非常重要，因為它可以清除嚴重受損的線粒體，減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生，抵消線粒體損傷的遺傳積累。許多研究表明，線粒體融合、裂變和線粒體自噬可能參與細胞衰老，而在多種年齡相關性疾病中也觀察到了線粒體動力學穩(wěn)態(tài)的失衡［22］。

線粒體裂變和融合分別由DNM1L 和MFN1/2介導，PINK1 則是線粒體自噬的主要調(diào)節(jié)因子。在本研究中，PINK1、DNM1L、MFN1/2 的表達在PCB118 暴露后都發(fā)生了顯著改變。DNM1L、MFN1 在A、B 組中表達升高，在C 組表達顯著降低，證實低、中濃度的PCB118 即可擾亂線粒體動力學的穩(wěn)態(tài)，而更高濃度的PCB118 可使線粒體損傷進一步加重。PINK1 靶向線粒體，穩(wěn)定狀態(tài)期間PINK1可以通過線粒體蛋白穿梭機制轉(zhuǎn)運到線粒體基質(zhì)中被蛋白酶降解，但在線粒體損傷的情況下、線粒體膜電位降低，PINK1 無法轉(zhuǎn)移到線粒體中被降解［23］。本研究中，PINK1 在PCB118 暴露組表達上調(diào)，反映PCB118 暴露后甲狀腺組織中受損線粒體積累，這可能與PCB118加速了甲狀腺衰老相關。

綜上所述，PCB118 腹腔注射的大鼠甲狀腺功能減退、甲狀腺組織衰老程度高，衰老基因p16、p21 表達升高，衰老相關分泌表型標志物IL-6 mRNA、TNFα mRNA 及MMP13 mRNA 表達升高，線粒體線粒體動力學相關蛋白PINK1 mRNA、DNM1L mRNA、MFN1 mRNA 表達升高。PCB118 可能通過誘導大鼠甲狀腺組織線粒體動力學紊亂、上調(diào)衰老基因表達、促進衰老衰老相關分泌表型標志物表達，促進甲狀腺組織衰老，導致大鼠甲狀腺功能減退。