孕早期大鼠剖宮取出胚胎后機械刮宮方法構建宮腔粘連模型

譚琴，劉曉云

遵義醫科大學第三附屬醫院（遵義市第一人民醫院）婦產科，貴州遵義 563000

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA），又稱Asherman 綜合征［1］，指由于人工流產、刮宮、流產后出血、人工胎盤摘除、息肉切除等醫源性損傷，及感染、生殖器結核、子宮內膜炎等病理性損傷從而引起月經異常、胎盤異常、周期性下腹痛及繼發不孕等各種臨床癥狀的一種婦科疾病［2］。目前IUA 的發病機制、臨床癥狀、治療及治療后宮腔再粘連的發生機制尚不明確。研究［3］發現，IUA 的主要危險因素是流產后刮宮。以往研究人員使用物理損傷、化學損傷、機械損傷和兩種方法相結合的雙重病理損傷模型［4-5］等多種方法構建動物IUA 模型。以上模型均建立在非妊娠動物的基礎上，并且導致IUA 的物理或化學方法引起的子宮內膜損傷與IUA患者的實際臨床原因以及IUA在體內隨后的病理變化存在一定差異，導致構建的IUA 模型在模擬人類IUA 病發生機制時不夠完全準確［6］。因此，探索和構建更符合人類IUA 的動物模型是十分必要的。2021年7月—12 月，我們以妊娠早期大鼠為研究對象，采取孕早期大鼠剖宮取出胚胎后機械刮宮方法構建IUA 模型，并通過觀察模型大鼠IUA 組織的組織病理學變化進行建模判斷，旨在為進一步探索IUA 發病機制和治療方法提供一種更理想的動物模型。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 SPF 級8～9 周齡SD雌性大鼠48 只，體質量240～280 g，陰道涂片法篩選出動情周期穩定大鼠；SPF 級9～10 周齡SD 雄性大鼠8 只，體質量300～320 g；動物均由遵義醫科大學實驗動物中心提供。雌性大鼠每4 只一籠，飼養于遵義醫科大學第三附屬醫院中心實驗室，晝夜各12 小時，溫度、濕度適宜，自由覓食，飲水。實驗前適應性喂養1周。蘇木精-伊紅（HE）染液（北京中杉金橋），Masson 染液試劑盒（北京索萊寶），4%多聚甲醛（武漢德博士），TGF-β1（北京中杉金橋），SP 法免疫試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 SD雌性大鼠分組及IUA造模方法 將48只動情周期穩定的雌鼠隨機分為A、B、C、D 四個組，每組12 只。A、B、C 組雌鼠與雄鼠和籠喂養，陰道涂片法篩選出妊娠大鼠，記為妊娠第0.5天，于妊娠第5.5～6.5 天采用孕早期流產后機械刮宮方法構建IUA 模型。具體如下：操作前禁食、禁飲12 h，2%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 mg 腹腔注射麻醉，麻醉后將雌鼠固定于操作臺上。備皮消毒鋪無菌洞巾，逐層分離下腹壁，暴露出紅潤的“Y”形子宮。將子宮拉到體外，于子宮中段縱向開一約0.5 cm 的縱形切口，用專用刮匙完整取出兩側胚胎后在子宮切口的上下來回地搔刮子宮內膜，搔刮至子宮內壁毛糙時停止，縫合切口，生理鹽水沖洗腹腔后關腹。A、B、C 組刮宮后繼續飼養1、2、3 個動情周期。D 組為常規飼養非孕鼠，不與雄鼠和籠，打開宮腔后即縫合并關腹，不刮宮。造模后，所有實驗大鼠均可蘇醒，蘇醒后精神狀態良好，進食、排便及活動正常；各組大鼠手術切口均未發生感染，傷口愈合良好，無死亡。

1.3 大鼠IUA模型的評價 子宮形態改變、子宮內膜腺體數目減少、纖維化程度增加表示建模成功；TGF-β1的相對表達量用于評估IUA 的嚴重程度，和籠實驗用于評估宮腔粘連對大鼠妊娠能力的影響。

1.3.1 各組大鼠子宮形態及子宮內膜腺體數目觀察 造模完成后每組各取6 只大鼠，處死后收集雙側子宮標本，觀察大鼠子宮解剖形態的變化。取子宮組織，4%多聚甲醛固定24 h，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制作石蠟切片。HE染色后測算各組大鼠子宮內膜腺體數目。將切片置于65 ℃電熱烤箱中至石蠟溶化，浸泡于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各10 min。然后依次置于100%、100%、95%、95%、85%、75%的酒精中浸泡2 min，蒸餾水沖洗1 min。蘇木素染色10 min，水洗，鹽酸酒精分化15 s，自來水反藍10 min，伊紅染色1 min。65 ℃電熱烤箱中烘干玻片，中性樹脂封片，倒置相差顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇4個200×放大倍率視野進行腺體計數，取平均值，腺體數目減少表少建模成功。

1.3.2 各組大鼠子宮內膜纖維化程度觀察 采用Masson 染色法觀察各組大鼠子宮內膜纖維化程度。取子宮內膜組織，新鮮配制的Weigert鐵蘇木素染色10 min，酸性乙醇分化15 s，Masson 藍化液染色5 min，麗春紅品染色5 min，磷鉬酸2 min，苯胺藍染色2 min。以上每一次操作后均用純水水洗后再進行下一步操作。65 ℃烘干玻片，中性樹脂封片，倒置相差顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇4 個200×放大倍率視野進行纖維化評估，取平均值，纖維化程度增加表示建模成功。按0～3［7］的改良半定量評分：子宮內膜組織無纖維化計0分、內膜組織松散纖維化計1分、中度纖維化計2分、致密纖維化計3分。

1.3.3 各組大鼠子宮內膜組織TGF-β1檢測 采用免疫組化法檢測。按照通用SP 檢測試劑盒說明書進行免疫組化操作，倒置相差顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇4個400×放大倍率視野進行染色程度與染色范圍判斷，其分值相加后求出積分值。染色程度判斷標準為陰性計0 分、弱陽性計1 分、中等陽性計2 分、強陽性計3 分；染色范圍判斷標準為無陽性染計0 分、≤25%計1 分、26%～50%計2 分、51%～75%計3 分、≥76%計4 分［8］。實驗重復3 次，取平均值，TGF-β1相對表達量增加表示IUA程度加重。

1.3.4 各組大鼠妊娠能力觀察 采用和籠實驗。有生育能力的成年SD 雄性大鼠8 只，將每組剩余6只大鼠隨機以3：1 比例與雄鼠和籠，和籠后進行陰道涂片，涂片可見精子計為妊娠第0.5天，若未見精子，繼續和籠直至陰道涂片見精子為止。將妊娠大鼠分籠飼養，于妊娠第14.5 天處死孕鼠，摘除子宮統計雙側子宮內胚胎數目，觀察胚胎植入變化。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件進行數據處理。計量資料采用shapiro-wilk test 方法進行正態性檢驗，正態分布的計量資料用以±s表示，組間比較采用獨立樣t檢驗，多樣本均數間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠子宮解剖形態 造模后D 組大鼠子宮形態規則、彈性豐富；A 組子宮形態欠規則、彈性較差；B 組子宮部分宮腔內見血凝塊，部分見下段粘連，上段積液，C 組子宮形態改變與B 組相似。造模后各組大鼠子宮解剖形態見圖1。

圖1 造模后各組大鼠子宮解剖形態

2.2 各組大鼠子宮內膜腺體數目 造模后D 組大鼠子宮內膜結構完整、腺體豐富，形態規整；A 組大鼠子宮內膜結構破壞、腺體數目減少，腺腔擴張；B組大鼠子宮內膜變薄或者缺失、腺體數目顯著減少，腺腔擴張或者閉合；C 組大鼠子宮內膜腺體改變與B 組相同。 A、B、C、D 組大鼠子宮內膜腺體數目分別為（6.771 ± 1.417）、（3.104 ± 1.505）、（3.063 ± 1.341）、（11.979 ± 1.780）個。與D 組相比，A、B、C 組大鼠子宮內膜腺體數目少（P均<0.05）；與B、C 組相比，A 組大鼠子宮內膜腺體數目多（P均<0.05）。

2.3 各組大鼠子宮內膜纖維化評分比較 造模后D組大鼠子宮內膜間質見少許松散淡藍色纖維；A組大鼠子宮內膜間質見中量稍致密藍色纖維；B組大鼠子宮內膜間質見大量致密深染藍色纖維，C組大鼠子宮內膜間質見大量致密深染藍色纖維。A、B、C、D組大鼠子宮內膜纖維化評分分別為（1.729 ± 0.449）、（2.667±0.476）、（2.583±0.498）、（0.687±0.468）分。與D組相比，A、B、C組大鼠子宮內膜纖維化評分高（P均<0.05）；與B、C組相比，A組大鼠子宮內膜纖維化評分低（P均<0.05）。

2.4 各組大鼠子宮內膜TGF-β1相對表達量比較造模后A、B、C、D 組大鼠子宮內膜TGF-β1相對表達量分別為（6.127 ± 0.710）、（6.291 ± 0.724）、（4.041 ± 0.742）、（2.125 ± 0.936）。與D 組相比，A、B、C 組大鼠子宮內膜TGF-β1相對表達量升高（P均<0.05）；與B、C組相比，A組大鼠子宮內膜TGF-β1相對表達量低（P均<0.05）。

2.5 妊娠第14.5 天各組大鼠雙側子宮胚胎情況比較 造模后妊娠第14.5 天D 組大鼠雙側子宮均見大量胚胎植入，排列緊密。A 組大鼠子宮形態不規則，可見胚胎植入，但數目顯著減少，排列稀疏。B、C 組大鼠子宮腔下段閉塞，上端積液，未見胚胎植入。A、B、C、D 組大鼠雙側子宮胚胎數目分別為（2.08 ± 1.16）、0、0、（6.75 ± 1.14）個。與D 組相比，A 組大鼠雙側子宮胚胎數目少（P<0.05）。造模后各組大鼠雙側子宮內胚胎見圖2。

圖2 各組大鼠雙側子宮內胚胎

3 討論

近年來，IUA 的發病呈年輕化趨勢［9］。自20 世紀70年代以來，許多研究者嘗試了各種方法來建立動物IUA模型。祖珍玉等［10］以新西蘭大白兔為實驗對象，用刮匙刮除子宮內膜模擬臨床刮宮術，結果顯示，在不給予雌孕激素的前提下，模擬刮宮14 天后子宮形態基本恢復、腺體數目與對照組相比無差異、纖維化程度與對照組相比略升高，但差異無統計學意義。表明子宮內膜傾向于在單純機械損傷不久后修復和再生。由于實驗動物的子宮內膜再生性很強，使得構建的IUA 動物模型很難保持穩定性。隨后研究人員探索了結合兩種或兩種以上的損傷方法來構建IUA動物模型。劉芳等［11］通過基于刮宮術切除卵巢減低雌孕激素水平或使用細菌脂多糖誘導宮內感染，獲得了雙重病理損傷IUA 模型。盡管這些物理或化學損傷方法對子宮內膜均造成不同程度的損傷，甚至導致IUA，但這種子宮內膜損傷或者粘連相關病變并不完全符合IUA臨床實際。

非妊娠SD 大鼠的子宮腔直徑小、子宮壁厚，單純機械刮宮難以有效刮除子宮內膜并造成損傷，而且大鼠子宮內膜自我修復能力較強，從而使得構建的動物模型既不穩定也不符合IUA發病的主要臨床病因學。與非妊娠大鼠相比，妊娠大鼠的子宮在妊娠期間會變得越來越薄和柔軟，胚胎清除后，子宮腔擴大，機械性刮宮可充分刮除上皮層甚至損傷基底層，這一過程是對人類刮宮程序更加精準的模仿。本研究結果發現，與D 組比較，A 組大鼠子宮內膜變薄，腺體數目減少，纖維化程度增加；與A 組比較，B組子宮內膜嚴重變薄甚至缺失，腺體數目嚴重減少甚至閉合，子宮內膜呈現嚴重纖維化。可以得出流產后機械刮宮法導致子宮內膜損傷是一個漸進性過程，其隨著時間推移損傷逐漸加重，這與臨床IUA的演變過程相符。子宮內膜受損傷后可引起子宮內膜變薄，腺體數目減少、間質萎縮，腺上皮生長緩慢，同時纖維組織明顯增生，內膜逐漸瘢痕化。其中子宮內膜腺體數量及纖維化程度被大多數研究者作為評價損傷子宮內膜修復及再生的指標［12-13］。本研究結果發現，與B 組相比，C 組大鼠子宮內膜厚度及腺體數目無明顯改變，子宮內膜纖維化程度無明顯改變，表明子宮內膜受損嚴重，不能有效修復與再生，提示構建的IUA模型是有效且穩定的。

TGF-β1是一種強效的促纖維化介質［14］，常被用于評估動物模型中IUA的嚴重程度。本研究結果顯示，D組大鼠子宮內膜中TGF-β1呈現弱陽性表達，表達范圍小；而A 組大鼠子宮內膜中TGF-β1呈中等陽性表達，表達范圍較D 組增加；B、C 組子宮內膜中TGF-β1呈強陽性表達，幾乎全染色，提示IUA的嚴重程度逐漸增加。

子宮內膜損傷后再生可能取決于兩個主要因素：快速再生的子宮內膜表面上皮細胞有效的覆蓋子宮內膜傷口，以及較輕的炎癥反應［15-16］。在妊娠大鼠流產后機械刮宮模型中，流產后卵巢功能尚未恢復，雌激素處于低水平狀態［9］，不能有效促進子宮內膜表面上皮快速再生并覆蓋子宮內膜傷口，使得基質組織暴露和基質纖維活性增加，從而導致IUA的發生。而胚胎成功植入子宮內受許多因素的調節，包括子宮內膜容受性、雌孕激素水平、子宮內膜局部環境、胚胎及胚胎分泌的信號因子等［17］。其中，子宮內膜的厚度過薄可能會影響子宮內膜的容受性，從而導致胚胎著床的失敗［18］。因此厚度合適的子宮內膜能夠為胚胎的植入提供優良的附著場所，是確保妊娠結局良好的關鍵條件。本研究結果發現，與D 組比較，A 組大鼠子宮形態欠規則，彈性較差，內膜厚度變薄，腺體數目減少，纖維化程度增加，使得子宮內適宜胚胎植入的環境遭到破壞，從而導致胚胎植入的數量減少，且排列不規則。而B、C 組子宮下段粘連、上段積液，內膜嚴重減少甚至缺失，腺體數目嚴重減少甚至閉合，纖維化嚴重，子宮內膜不能有效修復與再生，從而不能成功植入胚胎。

綜上所述，采用孕早期流產后機械刮宮方法成功構建IUA大鼠模型，該模型大鼠妊娠能力降低，子宮內膜組織腺體數目少、纖維化程度高、TGF-β1表達高。