子宮頸鱗狀細胞癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT的表達變化及其意義

李玉英，趙麗，王蕾，焦今文，袁芳

1 青島大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東青島 266071；2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科

子宮頸鱗狀細胞癌（以下簡稱宮頸鱗癌）是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，是女性第四大常見癌癥，目前發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年宮頸惡性腫瘤發(fā)病率逐年上升［1］。免疫治療已成為目前宮頸癌治療的研究熱點，細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4（cy‐totoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）抑制劑和程序性細胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡受體配體-1（Programmed death-li‐gand1，PD-L1）抑制劑目前已用于黑色素瘤、肺癌、腎癌和霍奇金淋巴瘤［2］等的治療中。CTLA-4 可與CD28 競爭性結(jié)合CD80、CD86，抑制CD28 將活化的信號傳遞給T 細胞，使T 細胞不能徹底活化，促進腫瘤細胞的“免疫逃逸”［3］。僅10%～30 的宮頸鱗癌患者采用CTLA-4、PD-1/PD-L1 免疫治療效果較好。T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T cell immunoglobulin do‐main and mucin domain containing molecule 3，TIM-3）、淋巴細胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）、T細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸基抑制模體（T-cell immunoglobulin and immuno Tyrosine inhibitory motif（ITIM）domain）是最新發(fā)現(xiàn)的免疫抑制分子。目前TIM-3、LAG-3 及TIGIT 在宮頸鱗癌中相關(guān)研究報道較少。我們觀察了宮頸鱗癌組織中TIM-3、LAG-3和TIGIT的表達變化，并分析其與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，旨在為宮頸鱗癌的免疫治療提供新靶點。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 宮頸鱗癌、子宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）、正常宮頸組織均來自于青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科2013年3月—2016年8月份存檔的手術(shù)切除或活檢保存的蠟塊標(biāo)本。宮頸鱗癌及CIN 患者均不合并其他類型腫瘤，術(shù)前均未接受放化療治療，且臨床資料完整。因?qū)m頸癌行子宮切除且術(shù)后病理證實為宮頸鱗狀細胞癌、有完整隨訪資料的鱗癌患者40 例，年齡33～70歲（50.23±7.87），其中腫瘤高分化3 例、中分化23例、低分化14 例；根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（Internation‐al Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）2009年分期標(biāo)準(zhǔn)為ⅠA～ⅠB1患者34例，ⅠB2～ⅡA患者6 例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9 例；浸潤肌層程度<1/2患者21 例，≥1/2 患者19 例。子宮頸錐切術(shù)后且術(shù)后病理證實為CIN 的患者20 例，因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)且術(shù)后病理證實為子宮平滑肌瘤患者的正常宮頸組織30 例。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則，征得患者及其家屬的知情同意、醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 宮頸鱗癌、CIN 及正常宮頸組織TIM-3、LAG-3、TIGIT 檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法。TIM-3、LAG-3抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TIGIT 抗體購自美國abcam 公司，超敏兔及鼠兩分法試劑盒（PV-9001）、DAB 試劑盒購自北京中杉金橋公司。將石蠟切片標(biāo)本于二甲苯及乙醇中脫蠟水化，PBS 浸泡抗原修復(fù)，一抗（TIM-3 抗體、LAG-3抗體及TIGIT抗體）以1∶50濃度滴于標(biāo)本載玻片上，4 ℃過夜，恢復(fù)室溫培養(yǎng)后滴加二抗，DAB 顯色劑顯色，蘇木素再次復(fù)染，脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。TIM-3、LAG-3、TIGIT 主要在細胞膜、細胞質(zhì)中表達。細胞染色強度為無著色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分；陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比得分為<5%計0 分、5%～25%計1分、26%～50%計2分、51%～75%計3分、>75%計4 分。將細胞染色強度與陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)百分比的得分乘積為最終半定量分析結(jié)果，乘積0 分計為細胞陰性，成績≥1 分計為陽性。測算TIM-3、LAG-3、TIGIT的陽性細胞率。

1.3 資料收集及統(tǒng)計學(xué)方法 收集納入者年齡、腫瘤直徑、臨床分期、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管轉(zhuǎn)移等資料。采取電話詢問、短信等方式對宮頸鱗癌患者進行隨訪，患者手術(shù)日期為隨訪起點，死亡為隨訪終點，2020 年1 月為隨訪截止時間。采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或者是Fisher’s 確切概率法。TIM-3、LAG-3 和TIGIT 表達與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，采用Kaplan-Meier 法進行單因素生存分析，并繪制生存曲線，采用逐步回歸法建立COX 比例風(fēng)險回歸模型分析宮頸鱗癌患者預(yù)后的影響因素。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌、CIN及正常宮頸組織TIM-3、LAG-3、TIGIT 陽性表達率比較 宮頸鱗癌組織中TIM-3、LAG-3 及TIGIT 陽性表達率分別為57.5%（23/40）、65.0%（26/40）、65.0%（26/40）；CIN 組織TIM-3、LAG-3 及TIGIT 陽性表達率分別為25.0%（5/20）、30.0%（6/20）、30.0%（6/20）；正常宮頸組織TIM-3、LAG-3 及TIGIT 陽性表達率分別為3.3%（1/30）、3.3%（1/30）和6.67%（2/30）。與正常宮頸組織比較，頸鱗癌組織、CIN 組織及正常宮頸組織TIM-3、LAG-3、TIGIT 陽性表達率均升高（P均<0.05）；與CIN 組織比較，宮頸鱗癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT陽性表達率均升高（P均<0.05）。

2.2 不同病理參數(shù)的宮頸鱗癌患者宮頸癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT 表達情況比較 同病理參數(shù)的宮頸鱗癌患者宮頸癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT表達情況見表1。TIM-3、TIGIT 陽性表達與宮頸鱗癌患者腫瘤浸潤深度相關(guān)（χ2=3.879，5.871；P均<0.05），與患者年齡、腫瘤直徑、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤情況均無關(guān)（P均>0.05）。LAG-3 陽性表達與宮頸鱗癌患者各臨床病理參數(shù)均無關(guān)（P均>0.05）。

表1 不同病理參數(shù)的宮頸鱗癌患者宮頸癌組織TIM-3、LAG-3、TIGIT表達情況（例）

2.3 不同TIM-3、LAG-3 表達的宮頸鱗癌患者的預(yù)后 40 例宮頸鱗癌患者隨訪時間為1～62 個月，中位隨訪時間30 個月，TIM-3、LAG-3 陽性表達宮頸鱗癌患者的生存曲線明顯低于陰性表達者（P均<0.05）。不同TIM-3、LAG-3 表達的宮頸鱗癌患者的生存曲線見圖1。

圖1 不同TIM-3、LAG-3表達的宮頸鱗癌患者的生存曲線

2.4 宮頸鱗癌患者預(yù)后的影響因素分析 單因素分析結(jié)果提示，宮頸鱗癌患者的生存時間與TIM-3陽性表達、LAG-3陽性表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)（P均<0.05），而與患者年齡、腫瘤直徑、臨床分期、浸潤深度、脈管浸潤無關(guān)（P均>0.05）。COX 多因素回歸分析結(jié)果為，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和TIM-3 陽性表達實影響宮頸鱗癌患者生存的獨立危險因素（HR分別為4.553，3.979，0.285；95%CI分別為0.994～20.843，1.051～15.064，0.109～0.750；P均<0.05）。

3 討論

宮頸癌的發(fā)病率呈逐年遞增。與手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)治療方法不同，免疫治療可通過調(diào)節(jié)或者操縱患者的免疫系統(tǒng)來發(fā)揮治療作用［4］，在腫瘤微環(huán)境中，免疫檢查點可以抑制T細胞抗腫瘤效應(yīng)；而免疫檢查點抑制劑通過阻斷這些分子，可以從一定程度激活T 細胞，恢復(fù)其抗腫瘤免疫效能［5］；目前應(yīng)用于臨床的抗PD-1、PD-L1和CTLA-4等免疫檢查點抑制劑在黑色素瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌和結(jié)腸癌等應(yīng)用在病理應(yīng)答率和無復(fù)發(fā)生存期等方面取得顯著的臨床效果［6］，且目前針對PD-1、PD-L1 等免疫檢查點的治療已經(jīng)應(yīng)用于宮頸癌的治療，但是由于不同患者具有多樣的抗原，相同抗原的一致率較低，以致單藥治療的應(yīng)答率較低，部分患者出現(xiàn)不良反應(yīng)甚至產(chǎn)生獲得性耐藥性。目前對于轉(zhuǎn)移性宮頸癌免疫治療［7］，已有免疫檢查點抑制劑應(yīng)用于臨床，但是隨著免疫相關(guān)不良反應(yīng)事件發(fā)生以及較低的免疫應(yīng)答率，研究者們開始尋找新的免疫檢查點。

TIM-3 蛋白是TIM 家族中的主要組員［8］，在免疫抑制反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。TIM-3 是由N 端免疫球蛋白可變區(qū)、粘蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞尾部構(gòu)成［9］。其不僅直接表達于Th1 細胞，在腫瘤浸潤淋巴細胞（Tumor infiltrating leukocytes，TILs）、巨噬細胞和抗原呈遞細胞（antigen presenting cells，APCs）等分子上廣泛地表達。表達于TILs表面TIM-3主要通過與其配體半乳糖凝集素-9（Galectin-9，Gal-9）結(jié)合調(diào)控免疫細胞的功能，下調(diào)對Th1細胞反應(yīng)，進而促進Th1 細胞凋亡，抑制T 細胞抗腫瘤活性［10］。TIM-3 參與自身免疫性疾病發(fā)展過程，且隨著病情的進一步發(fā)展，TIM-3 陽性表達呈下降趨勢。在艾滋病病毒感染患者中，TIM-3 作為一種免疫受體可以抑制T 細胞的免疫反應(yīng)，進一步促進T 細胞的衰竭。對TIM-3 的阻斷作為PD-1 和CTLA-4 抑制劑之外新型腫瘤免疫治療策略正在進行研究。本研究中，在宮頸鱗癌中TIM-3的陽性表達率高于CIN組和正常組織，CIN 組高于正常宮頸組，由此結(jié)果分析TIM-3 可能在宮頸鱗癌發(fā)展過程中發(fā)揮促進作用。我們還分析了TIM-3 與宮頸鱗癌等各種臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)TIM-3陽性表達率主要與腫瘤浸潤深度有關(guān)表明隨著浸潤深度的增大，其陽性表達也呈現(xiàn)遞增趨勢。據(jù)TIM-3陽性表達與卵巢癌、胃癌等惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)，可能參與疾病的發(fā)展進程。但是TIM-3 在臨床研究中的作用同樣存在相互矛盾之處，食管鱗狀細胞癌患者TIM-3蛋白的表達與患者PFS無明顯相關(guān)性。在本研究結(jié)果中，TIM-3蛋白陽性表達宮頸鱗癌患者的PFS 顯著短于TIM-3陰性患者，與其在鼻咽癌、肝癌中的陽性表達結(jié)果相一致［11］，表明其在宮頸癌發(fā)展過程中起促進作用。通過對單一因素和多因素的回歸模型分析，TIM-3可成為評估宮頸癌預(yù)后的獨立危險因素，預(yù)測其可成為宮頸癌免疫治療的檢查點之一。

LAG-3 是一種由498 個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白［12］，主要表達于活化T 細胞（CD4+T 細胞、CD8+T 細胞）、NK 細胞、調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg 細胞）和漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC），與CD4 蛋白具有高度的結(jié)構(gòu)同源性，能夠結(jié)合MHCII 類分子，抑制T 細胞的增殖及活化［13］；大量研究表明，除MHCII類分子以外，半乳糖凝集素-3（Galectin-3）、肝竇內(nèi)皮細胞凝集素（liver sinusoidal endothelial cell lectin，LSECtin）和α-突觸核蛋白纖維也作為LAG-3 配體［14］，目前對于LAG-3 作用機制尚不清楚，仍然需要大量的數(shù)據(jù)研究。WOO 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在臨床研究中，免疫蛋白LAG-3 與PD-1 在TILs 中共表達，此結(jié)果為后續(xù)LAG-3 免疫檢查點抑制劑與其他ICIs聯(lián)合應(yīng)用奠定了臨床試驗基礎(chǔ)。目前已經(jīng)研究出了針對兩種蛋白作用途徑的阻斷劑，但是尚未應(yīng)用于臨床。在惡性腫瘤與慢性感染等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均存在T 細胞的失活與衰竭，PD-1呈高表達，免疫蛋白LAG-3作為PD-1共抑制受體在惡性腫瘤或慢性感染患者免疫微環(huán)境中T細胞上高表達，嚴重影響患者生存時間及不良預(yù)后。目前對于LAG-3 作用機制尚不清楚，仍然需要大量的數(shù)據(jù)研究。本研究結(jié)果示，在宮頸鱗癌中LAG-3 的陽性表達率高于CIN 組和正常組織，CIN 組高于正常宮頸組，表明LAG-3在子宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起促進作用。在40例宮頸鱗癌患者樣本中，免疫蛋白LAG-3陽性表達與腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤等無明顯關(guān)系。K-M生存分析結(jié)果顯示LAG-3 陰性表達的宮頸鱗患者PFS較LAG-3陽性宮頸鱗癌患者PFS生存時間更長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），預(yù)示LAG-3 可能影響患者生存預(yù)后。多因素結(jié)果分析顯示各臨床病理因素均不是LAG-3 陽性表達的獨立危險因素，與DATAR［15］在非小細胞肺癌中得出的結(jié)論不一致，這可能與選取樣本量不足以及實驗方法等有關(guān)。在未來的研究中可以在大樣本中進行檢測，進一步驗證其結(jié)論。

TIGIT（又稱VSIG9，VSTM3，WUCAM）是TIGIT基因編碼的免疫球蛋白PVR（脊髓灰質(zhì)炎病毒受體）家族成員之一［16］，主要表達于CD4+T 細胞、CD8+T 細胞以及NK 細胞上，TIGIT 通過結(jié)合兩個配體CD115 和CD112 傳遞抑制信號，發(fā)揮抗腫瘤免疫效［17］。目前TIGIT 信號傳導(dǎo)機制上不清楚，一些實驗證明，TIGIT 在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫方面具有抑制作用，正如在免疫檢查點TIM-3 中觀察到的結(jié)果一致，抑制TIGIT 會加劇自身免疫疾病的發(fā)生。在晚期胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤患者活化T細胞中發(fā)現(xiàn)高表達的免疫蛋白TIGIT，提示其可作為一種免疫治療策略改善患者生存預(yù)后。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常宮頸、CIN組和宮頸鱗癌患者中，TIGIT蛋白表達率呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明TIGIT 可能在宮頸癌發(fā)展過程中發(fā)揮促進作用；在40例宮頸鱗癌患者中，TIGIT陽性表達率在肌層浸潤深度≥1/2中為84.21%，在肌層浸潤深度<1/2患者陽性表達率為47.62%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明浸潤深度可能促進宮頸鱗癌進一步發(fā)展；此對照分析食管鱗癌組織中的免疫調(diào)節(jié)蛋白TIGIT陽性表達率結(jié)果相一致，可以得出TIGIT蛋白陽性表達與子宮頸鱗癌發(fā)生、浸潤等一系列過程過程有關(guān)［18］；但是免疫檢查點TIGIT陽性表達與患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤等無明顯關(guān)系。根據(jù)K-M 生存分析結(jié)果示TIGIT 陽性表達與PFS無明顯相關(guān)。而在急性髓系白血病患者關(guān)于TIGIT 生存因素分析的研究實驗結(jié)果中，TIGIT蛋白陰性表達PFS明顯長于陽性表達患者，這與本研究課題的結(jié)果相悖；造成這種差異原因可能是基于不同類型實體腫瘤所處的體內(nèi)免疫調(diào)控微環(huán)境不同，且選擇的檢測診斷方法也不同以及樣本量大小的差異，有待進一步擴大檢測樣本含量深入研究。

綜上所述，宮頸鱗癌組織中免疫檢查點TIM-3、LAG-3和TIGIT 高表達，TIM-3、LAG-3與宮頸鱗癌患者生存時間呈負相關(guān)，TIM-3 陽性表達是影響宮頸鱗癌患者生存時間的獨立危險因素。宮頸鱗癌組織中TIM-3、LAG-3、TIGIT表達升高。TIM-3、TIGIT陽性表達與宮頸鱗癌患者腫瘤浸潤深度有關(guān)及患者預(yù)后有關(guān)。TIM-3、LAG-3可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展。TIM-3、LAG-3 和TIGIT 可能成為宮頸鱗癌的治療靶點的。本研究尚存在納入樣本量較少等不足，后續(xù)應(yīng)該進一步擴大樣本量來探究TIM-3、LAG-3和TIGIT在宮頸癌中的作用機制。