木尼孜其對加入順鉑培養的大鼠卵巢顆粒細胞性激素分泌及增殖調控作用觀察

劉莉，楊銀銀，夏米西努爾·伊力克

新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊 830054

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）又稱原發性卵巢功能不全，是指40歲以下的女性絕經后血清卵泡刺激素（FSH）>40 IU/L，繼發閉經≥4個月。POF 的臨床癥狀包括無排卵、閉經、并伴有FSH和LH 水平升高，E2 水平降低［1］。卵巢顆粒細胞（Granulosa cells，GC）是一種起源于卵巢性索的體細胞［2］，能夠支持發育中的卵母細胞產生類固醇激素和各種生長因子。GC 可以合成并分泌大量的E2，E2 對卵泡的發育起著負反饋的作用，并且能夠影響FSH、LH 分泌水平。順鉑（cisplatin，CP）是目前臨床上最有效的化療藥物之一［3］。當卵巢GC 發生化療性損傷時，體內的FSH 和LH 水平升高，E2 水平降低。因此檢測GC 損傷后FSH、LH 和E2 的分泌水平可以側面的反應POF 的嚴重程度。由于女性性腺對抗腫瘤藥物敏感度較高，CP 在治療腫瘤的同時可造成女性卵巢功能損傷，部分患者會進展為不可逆POF［4］。我們前期研究［5］發現，中藥木尼孜其可調解人體免疫力，降低炎癥水平，已用于痛經、更年期綜合征、盆腔炎等疾病的治療中。木尼孜其在化療性POF 中的作用及其具體機制尚不清楚。2020 年11月—2022 年1 月，我們從大鼠卵巢組織分離顆粒細胞，觀察木尼孜其對加入CP培養的大鼠顆粒細胞性激素分泌及細胞增殖的調控作用，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 5～6 周齡的雌性SD 大鼠60 只，體質量（200 ± 10）g；3 周齡的雌性SD 大鼠10只，體質量（60±10）g。大鼠均購買自新疆醫科大學動物實驗中心。購買自新疆醫科大學動物實驗中心。胎牛血清購自美國Gibco 公司；DME/F12 培養基（購自美國Hyclone）；青霉素、鏈霉素購自美國Hyclone；孕馬血清促性腺激素購自Solarbio 公司；CCK-8；卵泡刺激素受體（FSHR）購自美國Bioword公司；CP 購自Solarbio；ELISA 試劑盒購自Elab‐science 公司；木尼孜其（主要由小茴香、甘草、紅葡萄、無花果干、玫瑰花瓣等制成的中藥合劑）購自新疆烏魯木齊維吾爾自治區醫院；EpsonLX-800 酶聯免疫檢測儀；超凈臺；倒置顯微鏡；恒溫培養箱。

1.2 木尼孜其血清制備 將60 只5～6 周齡大鼠適應性喂養1周，隨機分為木尼孜其高、中、低劑量組，每組20只，木尼孜其高、中、低劑量組分別用木尼孜其合劑7.6、3.8、1.9 毫升/只灌胃，早晚各1 次，共灌胃7 d。第7 天早上將2 次劑量一次性灌胃，灌胃結束1～2 h 內采集三組大鼠腹主動脈，將同組大鼠血液混合，3 000 r/min離心20 min，獲取高、中、低劑量木尼孜其血清，-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 大鼠卵巢顆粒細胞制備

1.3.1 大鼠卵巢顆粒細胞分離 取3 周齡大鼠10只，適應性喂養1周。皮下注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）50 IU/只。注射48 h 時處死大鼠，分離卵巢組織并清洗，用1 mK的注射器針頭刺破卵泡釋放細胞，收集細胞懸液。在卵巢組織中加入0.25%的胰蛋白酶中消化60 min，消化結束后用濾網過濾，收集細胞懸液。將上述兩種細胞懸液混合后1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS 洗滌收集沉淀后再次離心。用含有10%胎牛血清的培養基重懸離心后細胞沉淀，在37 ℃、5%CO2條件下培養顆粒細胞，48h 后進行細胞換液。

1.3.2 大鼠卵巢顆粒細胞鑒定 FSHR 特異性表達于雌性動物卵巢顆粒細胞［5］，故采用免疫熒光法檢測細胞FSHR，從而鑒定卵巢顆粒細胞。將“1.3.1”中分離細胞接種至6 孔板中，待細胞生長密度達到80%左右時，PBS 洗滌3 次，加入4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，PBS 洗滌細胞，加入PBS 稀釋的5%TritonX-100，室溫靜置30 min。加入山羊血清工作液（按照說明書稀釋）室溫封閉30 min，棄血清并瀝干（此處不用PBS 清洗）。加入500 μL/孔的FSHR 一抗（1∶200 稀釋），4 ℃冰箱孵育過夜。次日加入500 μL/孔的FITC 山羊抗兔二抗，37 ℃恒溫箱中靜置1 h，靜置結束后用PBS 洗滌。避光滴加500 μL/孔的DAPI 染色液（1∶1 000 甲醇稀釋），避光靜置10 min，PBS 清洗后瀝干PBS 殘液。每孔加入300 μL的抗熒光淬滅封片劑，最后在熒光顯微鏡下隨機選取5 個視野測算大鼠卵巢顆粒陽性細胞數。5 個視野下大鼠卵巢顆粒細胞陽性率均>90%，判定成功分離卵巢顆粒細胞。

1.4 大鼠卵巢顆粒細胞分組及木尼孜其血清給予方法 取大鼠卵巢顆粒細胞，接種到6孔板中，分為3組，1組18個復孔，2、3組各6個復孔。當細胞生長密度達到90%左右時，其中1、2組加入5 μg/mL的CP培養48 h［6］，培養后1組再分為三個亞組，分別加入高、中、低劑量木尼孜其血清培養。2組為CP組，3組為正常對照組，均用含有10%胎牛血清的培養基培養。

1.5 各組大鼠卵巢顆粒細胞FSH、LH 和E2 檢測 采用ELISA 法。培養48 h 時取各組細胞培養液，ELISA 法檢測細胞培養液FSH、LH 和E2。所有操作均嚴格按照使用說明書進行。實驗重復3 次，取平均值。

1.6 各組大鼠顆粒細胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。分別于培養24、48、72、96 h 時，取各組細胞，200 μL 的PBS 清洗細胞，加入10%胎牛血清的培養基和CCK-8 的混合液100 μL（10%胎牛血清的培養基：CCK-8=100∶1），培養2 h用酶標儀讀取450 nm波長處的光密度值（OD450 值）。實驗重復3 次，取平均值。

1.8 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件進行數據處理。采用Shapiro-Wilk 檢驗驗證數據的正態性，符合正態分布的計量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠卵巢顆粒細胞培養液FSH、LH、E2水平比較 各組大鼠卵巢顆粒細胞培養液FSH、LH、E2水平比較見表1。

表1 各組大鼠卵巢顆粒細胞培養液FSH、LH、E2水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠卵巢顆粒細胞培養液FSH、LH、E2水平比較（pg/mL，±s）

注：與3 組比較，*P<0.05；與2 組比較，#P<0.05；與低劑量木尼孜其者比較，＆P<0.05；與中劑量木尼孜其比較，ΔP<0.05。

組別1組高劑量木尼孜其中劑量木尼孜其低劑量木尼孜其2組3組FSH LH E2 2.66±0.14#＆Δ 2.03±0.04 2.33±0.11 0.25±0.11*1.72±0.06 57.92± 1.25#＆Δ 59.21± 2.28 76.67± 3.00 511.66±381.48*89.95± 1.23 4.43± 3.68#＆Δ 5.36± 3.78 4.54± 3.28 74.03±37.62*18.41± 7.05

2.2 培養24、48、72 及96 h 時各組卵巢顆粒細胞OD450 值比較 培養24、48、72、96 h 時各組卵巢顆粒細胞OD450值比較見表2。

表2 培養24、48、72及96 h時各組卵巢顆粒細胞OD450值比較（±s）

表2 培養24、48、72及96 h時各組卵巢顆粒細胞OD450值比較（±s）

注：與3組比較，*P<0.05；與2組比較，#P<0.05；與低劑量木尼孜其者比較，＆P<0.05；與中劑量木尼孜其比較，ΔP<0.05。

組別1組高劑量木尼孜其中劑量木尼孜其低劑量木尼孜其2組3組OD450值培養24 h 培養48 h 培養72 h 培養96 h 0.630±0.033#＆Δ 0.340±0.020 0.520±0.025 0.180±0.005*0.480±0.031 0.860±0.034#＆Δ 0.460±0.020 0.350±0.021 0.430±0.014*0.590±0.013 1.170±0.054#＆Δ 0.550±0.045 0.800±0.065 0.310±0.013*0.640±0.034 0.800±0.064#＆Δ 0.500±0.033 0.650±0.082 0.250±0.007*0.600±0.027

3 討論

化療是臨床上常用的治療癌癥的手段，CP 作為臨床上常用的化療藥物在殺死癌細胞的同時常常伴隨著對正常組織，特別是分裂細胞的損傷。CP 可以對原始卵泡產生直接的毒性，可能會導致原始卵泡丟失，導致卵巢儲備枯竭，從而導致POF 的發生［6-7］。研究［8］發現，卵巢GC 負責傳遞內分泌激素以及細胞信號分子，從而來促進卵母細胞的發育和成熟，卵巢GC作為卵泡閉鎖的始動細胞，發生凋亡的時間早于卵母細胞和卵泡膜細胞，大量的卵巢GC 凋亡會影響卵泡的發育和成熟。卵巢GC 能夠分泌性腺激素來維持卵巢功能，卵巢GC 的增殖和凋亡與卵巢的功能密切相關。本實驗以5 μg/mL順鉑干預體外培養的卵巢GC來模擬卵巢早衰GC。

在本次研究中，成功分離并培養了GC，并成功建立了原代卵巢GC 體外培養體系。通過參考文獻［9-10］中的方法，獲取數量較多且細胞純度較高的GC。剛提取出的原代卵巢GC，培養至24 h，細胞長出短小的偽足，開始貼壁生長，此時處于貼壁適應期生長速度相對慢；48 h～72 h 細胞的吸光度值明顯增加，此時細胞開始大量的增殖，可以判斷顆粒細胞從48 h開始進入對數生長期，72 h吸光度值達到頂峰，72 h 后吸光度值沒有增加說明細胞進入平臺期，96 h 后細胞的吸光度值開始下降，說明細胞開始死亡。FSHR是一種G蛋白耦聯受體，特異表達在卵巢GC 的細胞質中［11-12］，因此本實驗采用FSHR 免疫熒光鑒定提取的卵巢GC，發現提取培養的細胞的FSHR的陽性率>90%，符合細胞實驗的要求。

木尼孜其是一種從中草藥混合物中提取的水提物，主要由小茴香、甘草、紅葡萄、無花果干、玫瑰花（瓣）等制成的中藥合劑，能夠調節機體的穩態平衡［13］。木尼孜其可以有效的調節機體內激素的合成以及代謝，減少線粒體的氧化和脫氧核糖核酸的損傷，治療內分泌紊亂引起的痤瘡、黃褐斑、痛經、更年期綜合征以及女性的生殖系統的炎癥［14-16］。由于中藥本身的成分多樣，組成較為復雜，對中藥作用機制的研究目前較少。針對中藥直接作用體外實驗研究的困難性，在20世紀80年代，日本學者Hiroko lwama首次提出了血清藥理學的這個概念，并開始用于藥效的評價以及中藥相關作用的研究［17］。目前藥理血清的實驗技術日趨于成熟，在心血管系統、呼吸系統、生殖系統、抗炎、抗菌、抗病毒等的研究中被廣泛的應用［18］。

在前期實驗中發現用木尼孜其干預慢性應激卵巢早衰的大鼠一段時間后，大鼠卵巢的分泌功能得到改善［19］。因此本實驗得到前期實驗的啟發，探討木尼孜其含藥血清對卵巢GC 分泌的性激素FSH、LH 和E2 的影響。FSH 和LH 是由同一個α-亞基（AGSu）組成的二聚體糖蛋白，并且還是與促甲狀腺激素和人絨毛膜促性腺激素同屬一類的異二聚體糖蛋白［20］。FSH 和LH 通過控制所有脊椎動物的性腺發育和成熟，在腦-垂體-性腺（BPG）軸中發揮重要作用。FSH 在雌性配子發生、精原細胞增殖和卵黃發生的早期階段起重要作用，而LH 主要參與雌性最終配子的發生、雌性卵母細胞成熟和排卵以及雄性精子發生和精子形成的過程。機體內FSH和LH 含量的多少是卵巢活動的決定因素［21-22］。在卵巢GC中，FSH 刺激卵泡的發育，LH 參與卵泡的發育和成熟，并且依賴FSH 和LH 的協同作用調節卵泡形成、GC的生長、排卵觸發等。FSH 和LH 的缺陷降低了配子的發生和性腺類固醇的產生，從而降低了女性的生育力。在卵泡膜細胞中，LH刺激雄激素的分泌，雄激素被轉移到卵巢GC，通過芳香化酶轉化為E2。E2現已被確認為是一種卵巢激素，并且是評估排卵前狀態的“金標準”，密切反映卵泡的發育和排卵的方式［23-25］。在卵泡早期，FSH 水平的增加，觸發了E2 的分泌，而E2 的大量分泌又反過來抑制FSH 的釋放。在卵泡晚期，LH 水平升高，刺激E2 的分泌，在月經周期的中期，E2 向下丘腦提供正反饋，引起FSH 和LH 的激增［26］。實驗中用5 μg/mL 的CP干預細胞48 h，建立卵巢GC 早衰模型，然后用不同濃度的木尼孜其含藥血清作用相同時間，2組與3組相比較，FSH 和LH 的水平升高而E2水平下降，說明CP 能夠造成卵巢GC的損傷。而木尼孜其含藥血清高劑量組與模型組相比較，FSH和LH的水平下降而E2 水平升高，說明高劑量的含藥血清對損傷的卵巢GC有一定改善作用。進而可以說明木尼孜其對卵巢GC 的分泌功能有一定的改善作用。用5 μg/mL 的CP 干預細胞48 h，建立化療性卵巢早衰的GC 模型，用CCK-8法比較不同濃度的木尼孜其含藥血清對CP損傷卵巢GC增殖能力的影響。結果提示：CP損傷卵巢GC后，用不同濃度木尼孜其含藥血清作用不同時間，發現模型組與正常對照組相比較，模型組細胞的OD 值減少。用不同濃度木尼孜其含藥血清分別作用于受損的卵巢GC后，發現各個劑量的木尼孜其含藥血清都能促進卵巢GC 的生長；其中高劑量（7.6 mL/只灌胃劑量）的含藥血清效果最好，并且隨著含藥血清濃度的增高，細胞的增殖率升高的越顯著。說明木尼孜其含藥血清對損傷的卵巢GC 的增殖能力有一定改善作用。但是本實驗僅是通過體外實驗來探討木尼孜其對卵巢早衰GC 分泌性激素的功能以及對細胞增殖能力的影響，因此還有待更多的體內實驗進行驗證。

綜上所述，木尼孜其可抑制順鉑培養的大鼠顆粒細胞FSH、LH表達、促進E2表達，木尼孜其可促進順鉑培養的大鼠顆粒細胞的增殖，并且木尼孜其濃度越高對細胞的增殖效果越明顯。因此在本研究中7.6 mL/只灌胃劑量的木尼孜其對加入順鉑培養的大鼠卵巢顆粒細胞性激素分泌及增殖調控作用最佳。