全自動(dòng)血液分析儀用于漿膜腔積液常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)可行性研究

王 沖， 朱 捷， 楊 爍， 顧梅秀， 潘柏申， 王蓓麗， 郭 瑋

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032）

漿膜腔積液常規(guī)檢查作為實(shí)驗(yàn)室檢測的重要組成部分，在漏出液和滲出液、癌性和非癌性積液、結(jié)核性和非結(jié)核性積液的鑒別診斷以及尋找致病原因等方面有重要意義。在日常工作中，雖然顯微鏡人工計(jì)數(shù)法（手工法）為白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類的金標(biāo)準(zhǔn)，但標(biāo)本充池、人工計(jì)數(shù)和標(biāo)本推片、染色、分類等操作對人員要求較高，不易標(biāo)準(zhǔn)化，且檢測過程耗時(shí)較長。相比人工計(jì)數(shù)法，全自動(dòng)血液分析儀（儀器法）檢測耗時(shí)短、效率高，能提高計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性、精密度和重復(fù)性，易于標(biāo)準(zhǔn)化。為此，本研究擬探討全自動(dòng)血液分析儀體液模式在漿膜腔積液標(biāo)本細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類檢測中代替人工計(jì)數(shù)法的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院住院患者各類漿膜腔積液標(biāo)本287例，包括胸腔積液171例、腹腔積液90例、心包積液26例。所有標(biāo)本均由臨床醫(yī)生采集，采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，并在采集后2 h內(nèi)完成細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類檢測[1]。所有標(biāo)本均排除肉眼可見的凝塊，儀器法檢測排除異常細(xì)胞、細(xì)胞分類散點(diǎn)圖異常，以及高熒光強(qiáng)度細(xì)胞升高的標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑

XN-20 A1全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑（日本Sysmex公司）；CX-31型顯微鏡（日本Olympus公司）；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）；瑞氏-吉姆薩染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器法細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性評估

在標(biāo)本采集2 h內(nèi)分別用手工法和儀器法對287例漿膜腔積液標(biāo)本進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測，以手工法為金標(biāo)準(zhǔn)，評估儀器法細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

1.4 儀器法白細(xì)胞分類準(zhǔn)確性評估

標(biāo)本采集2 h內(nèi)對手工法白細(xì)胞計(jì)數(shù)>50個(gè)/μL的252例標(biāo)本（排除3例異常白細(xì)胞高值標(biāo)本）進(jìn)行白細(xì)胞分類，將標(biāo)本以400 ×g離心5 min，取沉淀物推片制成均勻薄膜，經(jīng)干燥、染色、沖洗后，對有核細(xì)胞進(jìn)行分類，計(jì)算單個(gè)核細(xì)胞、多個(gè)核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的百分比；同時(shí)用XN-20 A1全自動(dòng)血液分析儀體液模式對252例標(biāo)本進(jìn)行白細(xì)胞分類。參照WS/T 246—2005《白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法》[2]，以手工法各分類細(xì)胞百分比的95%可信區(qū)間為判斷標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)儀器法細(xì)胞分類結(jié)果與手工法的符合率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，檢測結(jié)果比較采用配對t檢驗(yàn)和方差檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)相關(guān)性評價(jià)采用線性回歸分析，一致性評價(jià)采用Bland-Altman圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 儀器法細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性評估結(jié)果

2.1.1 儀器法與手工法白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的相關(guān)性 對于手工法白細(xì)胞計(jì)數(shù)為201～400個(gè)/μL（40例）和401～15 000個(gè)/μL（212例）的標(biāo)本，2種方法白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性較好（r值分別為0.873和0.993，P<0.05），見表1。配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，白細(xì)胞計(jì)數(shù)為0～200個(gè)/μL（32例）時(shí)，儀器法檢測結(jié)果高于手工法（P=0.013）；人、而白細(xì)胞計(jì)數(shù)為201～400個(gè)/μL和401～15 000個(gè)/μL時(shí)，2種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.134、P=0.246）。一致性分析結(jié)果顯示，白細(xì)胞計(jì)數(shù)為0～200個(gè)/μL時(shí)，有26組結(jié)果在95%可信區(qū)間內(nèi)，一致性較差；白細(xì)胞計(jì)數(shù)為201～400個(gè)/μL和401～15 000個(gè)/μL時(shí)，分別有39組和206組結(jié)果在95%可信區(qū)間內(nèi)，一致性較好；見圖1。手工法白細(xì)胞計(jì)數(shù)>15 000個(gè)/μL的標(biāo)本，有3例標(biāo)本儀器法與手工法檢測結(jié)果有差異（表2）；鏡檢發(fā)現(xiàn)1號標(biāo)本中存在大量破碎白細(xì)胞和膿細(xì)胞，儀器法檢測值明顯高于手工法，因此類標(biāo)本只有3例，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，后續(xù)也不再進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類的比較。

表1 2種方法白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性分析

圖1 2種方法白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性和一致性分析

表2 3例異常白細(xì)胞高值標(biāo)本2種方法檢測結(jié)果 個(gè)/μL

2.1.2 儀器法與手工法紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的相關(guān)性 對于手工法紅細(xì)胞計(jì)數(shù)>200個(gè)/μL的標(biāo)本，2種方法紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性均較好（P<0.05），見表3。配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)為0～200個(gè)/μL（26例）時(shí)，儀器法檢測值>手工法檢測值，但2種方法檢測結(jié)果無相關(guān)性（r=0.035，P=0.621）；一致性分析結(jié)果顯示，有23組數(shù)據(jù)位于95%可信區(qū)間內(nèi)。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)>200個(gè)/μL時(shí)，配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示2種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），一致性分析結(jié)果顯示2種方法一致性較好。見圖2。

表3 2種方法紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性分析

圖2 2種方法紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性和一致性分析

2.2 儀器法白細(xì)胞分類準(zhǔn)確性評估結(jié)果

儀器法與手工法白細(xì)胞分類檢測均將白細(xì)胞分為單個(gè)核細(xì)胞、多個(gè)核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞3類，儀器法對3類白細(xì)胞的檢測結(jié)果與手工法相關(guān)性較好（r值分別為0.998、0.971、0.977，P<0.05），見表4。配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，單個(gè)核細(xì)胞、多個(gè)核細(xì)胞2種方法結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.740、P=0.580）；嗜酸性粒細(xì)胞儀器法檢測值高于手工法檢測值（P=0.007）。一致性分析結(jié)果顯示，2種方法單個(gè)核細(xì)胞、多個(gè)核細(xì)胞結(jié)果的一致性較好；而嗜酸性粒細(xì)胞雖然大部分?jǐn)?shù)據(jù)位于95%可信區(qū)間內(nèi)，但在分析低值標(biāo)本時(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞儀器法檢測值高于手工法，2種方法一致性較差；見圖3。

表4 2種方法白細(xì)胞分類結(jié)果相關(guān)性

圖3 2種方法白細(xì)胞分類結(jié)果相關(guān)性和一致性分析

3 討論

漿膜腔積液是大量液體潴留漿膜腔內(nèi)而形成的積液，按積液部位不同分為胸腔積液、腹腔積液、心包積液[1]。漿膜腔積液常規(guī)檢查可鑒別積液性質(zhì)，為臨床診斷、治療提供依據(jù)。傳統(tǒng)的顯微鏡鏡檢是細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類的金標(biāo)準(zhǔn)，但標(biāo)本充池質(zhì)量直接影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性；進(jìn)行涂片分類時(shí)，標(biāo)本離心速度易影響細(xì)胞形態(tài)，沉淀物黏稠度、涂片后固定時(shí)間、環(huán)境溫度等均會(huì)對涂片質(zhì)量產(chǎn)生影響；對高濃度標(biāo)本，多倍稀釋會(huì)因稀釋誤差導(dǎo)致最終計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。總體來講，手工法操作復(fù)雜、耗時(shí)長，不易標(biāo)準(zhǔn)化，不同操作人員間結(jié)果可比性較差，開發(fā)新的方法對于漿膜腔積液細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類檢測非常重要。

2014年，國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）成立了體液細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀性能和驗(yàn)證國際工作組，為提供準(zhǔn)確而可靠的自動(dòng)化儀器體液的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，發(fā)布了有助于臨床實(shí)驗(yàn)室計(jì)劃和實(shí)施的自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀驗(yàn)證指南。指南中指出，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自動(dòng)化儀器檢測體液細(xì)胞計(jì)數(shù)的線性范圍，對超出線性范圍的標(biāo)本，應(yīng)稀釋后進(jìn)行檢測，或使用其他檢測方法[3]。采用自動(dòng)血液分析儀體液模式，配合商品化質(zhì)控品，可大大提高漿膜腔積液細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和精密度，易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化[4]。本研究對287例漿膜腔積液標(biāo)本進(jìn)行紅細(xì)胞和白細(xì)胞計(jì)數(shù)，并對其中252例標(biāo)本進(jìn)行白細(xì)胞分類檢測，樣本量大，結(jié)果更可靠，更具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究根據(jù)手工法白細(xì)胞計(jì)數(shù)對標(biāo)本進(jìn)行分組。當(dāng)白細(xì)胞計(jì)數(shù)為201～400個(gè)/μL和401～15 000個(gè)/μL時(shí)，儀器法與手工法白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性較好（r值分別為0.873和0.993，P<0.05）；對于32例白細(xì)胞計(jì)數(shù)≤200個(gè)/μL的標(biāo)本，儀器法與手工法檢測值和存在一定差異，且無相關(guān)性（r=0.032，P=0.333），但由于樣本量較少，還需進(jìn)一步分析，建議在體液白細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)，采用手工法計(jì)數(shù)。本研究中，有3例白細(xì)胞計(jì)數(shù)>15 000個(gè)/μL的標(biāo)本，2種方法檢測結(jié)果差異較大，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)1號標(biāo)本中存在大量破碎白細(xì)胞和膿細(xì)胞，儀器法檢測值明顯高于手工法。建議此種情況下，在報(bào)告中注明“見大量膿細(xì)胞”；對此類白細(xì)胞高值標(biāo)本，可適當(dāng)稀釋后用儀器法結(jié)合手工法進(jìn)行計(jì)數(shù)。XN-20 A1全自動(dòng)血液分析儀體液模式可對大多數(shù)體液標(biāo)本中的白細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，但對白細(xì)胞計(jì)數(shù)≤200個(gè)/μL或>15 000個(gè)/μL的標(biāo)本，建議用手工法進(jìn)行復(fù)檢。

本研究根據(jù)手工法紅細(xì)胞計(jì)數(shù)對標(biāo)本進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)>200個(gè)/μL時(shí)，2種方法相關(guān)性較好。然而在XN-20 A1全自動(dòng)血液分析儀體液模式下，紅細(xì)胞檢測通道最低檢出限為0.000 1×106個(gè)/μL，標(biāo)本中紅細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)（≤1 000個(gè)/μL），儀器法能檢測到的最少數(shù)量為100個(gè)/μL；紅細(xì)胞數(shù)量增加時(shí)，儀器法檢測值也只能以整百的數(shù)量級遞增，而漿膜腔積液中出現(xiàn)少量紅細(xì)胞多因穿刺損傷所致，紅細(xì)胞較多則提示為血性滲出液，多見于惡性腫瘤、結(jié)核和其他出血性疾病。因此，盡管當(dāng)體液中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)為201～1 000個(gè)/μL時(shí)2種方法結(jié)果相關(guān)性較好，但在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)≤1 000個(gè)/μL時(shí)，建議采用手工法對紅細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，以便為臨床診療提供可靠信息。對于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)>1 000個(gè)/μL的體液標(biāo)本，可采用儀器法計(jì)數(shù)報(bào)告結(jié)果。

漿膜腔積液白細(xì)胞分類是臨床鑒別漏出液和滲出液主要依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，白細(xì)胞計(jì)數(shù)>50個(gè)/μL的252例標(biāo)本，2種方法單個(gè)核細(xì)胞、多個(gè)核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞結(jié)果相關(guān)性較好；但對于低值標(biāo)本，儀器法嗜酸性粒細(xì)胞的檢測結(jié)果往往偏高，主要原因可能為儀器法檢測白細(xì)胞分類的最低檢出限為0.001×103個(gè)/μL，導(dǎo)致在細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)，更易表現(xiàn)為細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。臨床送檢的漿膜腔積液標(biāo)本多以異常為主，其中腫瘤患者標(biāo)本居多，此類標(biāo)本可能存在較多間皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞。有研究結(jié)果表明，有核細(xì)胞形態(tài)應(yīng)根據(jù)細(xì)胞散點(diǎn)圖并結(jié)合鏡下觀察綜合分析，高熒光參數(shù)值越高，檢出異常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的可能性越大。還有研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者體液標(biāo)本中，高熒光參數(shù)值細(xì)胞的識別率明顯更高，當(dāng)儀器提示標(biāo)本中有較多高熒光參數(shù)值細(xì)胞時(shí)，也需要進(jìn)行鏡下分析[4-5]。因此，當(dāng)儀器提示可能存在細(xì)胞分類散點(diǎn)圖異常或高熒光強(qiáng)度細(xì)胞數(shù)異常時(shí)，應(yīng)進(jìn)行手工法復(fù)檢，校正儀器分類結(jié)果[6]。漿膜腔積液標(biāo)本的性狀和送檢時(shí)間對于標(biāo)本的檢測結(jié)果也至關(guān)重要，儀器法檢測較為澄清的標(biāo)本結(jié)果較為準(zhǔn)確，對于渾濁或黏稠的標(biāo)本，儀器法檢測結(jié)果往往會(huì)出現(xiàn)偏差；另外，漿膜腔積液標(biāo)本是否及時(shí)送檢也會(huì)影響最終結(jié)果，送檢時(shí)間過長會(huì)使細(xì)胞碎裂，造成儀器法計(jì)數(shù)偏低[7-8]。

綜上所述，XN-20 A1全自動(dòng)血液分析儀體液模式對漿膜腔積液標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于臨床檢測。但對于部分細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞類型存在異常的標(biāo)本，仍需使用手工法進(jìn)行復(fù)檢。