連作對遼細辛土壤理化性質(zhì)和根際微生物群落特征的影響

于春雷， 高 嵩， 孫文松

(1.遼寧省經(jīng)濟作物研究所，遼寧遼陽 111000； 2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所，遼寧遼陽 111000)

遼細辛[Fr. Schmidt var.(Maxim.) Kitag.]為馬兜鈴科細辛屬，別稱北細辛、煙袋鍋花、東北細辛、細參等，多年生草本藥用植物。有祛風散寒、通竅、止痛、溫肺、化飲功效。用于風寒感冒、頭痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、風濕痹痛等。

截至2019年底，遼寧省撫順市新賓縣遼細辛種植面積達1 800 hm，細辛飲片年產(chǎn)量2 100 t，年綜合產(chǎn)值達3億元。遼細辛等中藥材產(chǎn)業(yè)已成為促進新賓縣農(nóng)業(yè)增效和區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展的核心產(chǎn)業(yè)。遼細辛為宿根藥用植物，其土壤經(jīng)過一茬種植后需要進行輪作其他作物。然而受生長年限、道地產(chǎn)區(qū)土地資源緊張和農(nóng)民種植習慣等因素影響，實際生產(chǎn)中往往重茬栽種遼細辛。導致遼細辛出現(xiàn)存苗率大幅度下降、病蟲害嚴重等諸多問題，甚至絕產(chǎn)，遼細辛生產(chǎn)中的連作障礙問題已經(jīng)嚴重限制產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

連作后土壤肥力下降、自毒物質(zhì)積累、微生態(tài)失調(diào)是連作障礙形成的主要原因。研究表明，連作體系下土壤微生物多樣性及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而影響土壤生產(chǎn)力。土壤細菌是土壤養(yǎng)分循環(huán)重要的驅(qū)動者，具有重要的生態(tài)功能。有研究表明，土壤真菌群落參與關(guān)鍵的生態(tài)過程，包含大量土傳病害的致病因子及拮抗因子。因此，土壤細菌真菌群落在根際微生態(tài)、病蟲害防控以及科學施肥方面，扮演重要角色。然而關(guān)于遼細辛根際微生物群落變化的研究很少，加強根際細菌真菌群落的研究來闡述遼細辛連作障礙機制非常必要。

本研究以遼寧省撫順市新賓縣不同生長年限遼細辛的根際土壤為研究對象，采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)分析根際微生物群落的組成及多樣性差異，分析遼細辛土壤速效養(yǎng)分的年際變化，并探究細菌與真菌群落年限變化與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，為緩解遼細辛連作土壤細菌代謝潛力、防治真菌病害提供參考，研究結(jié)果旨在從土壤微生物微生態(tài)關(guān)系方面為遼細辛的生產(chǎn)實踐提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 根際土壤樣品采集

本次研究對象為遼寧省撫順市新賓縣北四平村(125°19′44.33″N，41°80′51.8″E)山地的栽培遼細辛，采集地遼細辛的生長過程中水肥管理一致。于2019年9月進行土壤樣品采集，種植年限分別為2年實生苗移栽1、2、3、4年的遼細辛根際土壤(XX3、XX4、XX5、XX6)，試驗小區(qū)隨機排放且面積為1.2 m×5.0 m。按“S”形每個小區(qū)隨機選取5株遼細辛，采用“抖根法”收集根際土壤，同時在采樣區(qū)域50 m內(nèi)采集未種過遼細辛的園土作為對照(CK)，共計5個樣品，3次重復。去除雜質(zhì)后，過 2 mm 無菌篩網(wǎng)，1份用于土壤微生物群落鑒定，1份用于理化性質(zhì)的測定。

1.2 土壤理化性質(zhì)分析

土壤理化指標均按照《土壤農(nóng)化分析》中的方法測定：pH值采用酸度計法測定，土壤有機碳含量采用濃硫酸-重鉻酸鉀外加熱法測定，硝態(tài)氮含量采用堿解擴散法測定，速效磷含量采用碳酸氫鈉浸提鉬銻抗比色法測定，速效鉀含量采用乙酸銨浸提火焰光度計法測定。

1.3 土壤DNA的提取和高通量測序

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法提取土壤基因組DNA。ITS1區(qū)引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)用于鑒定真菌多樣性；使用引物(338F和806R)對采集土壤樣品中16S rDNA的 V3-V4 高變區(qū)進行 PCR 擴增，用于鑒定細菌多樣性。使用賽默飛世爾科技公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，進行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

使用Qiime軟件計算辛普森指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)等多樣性指數(shù)。使用R軟件繪制曲線，計算物種累積曲線，進行Alpha多樣性指數(shù)差異分析。利用Uparse軟件對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，同時選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。利用SPSS 2.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

與對照未種植遼細辛土壤相比，遼細辛根際土壤理化性質(zhì)如表1所示，連作會對土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生不同影響。連作使土壤pH值降低，有機質(zhì)含量逐年下降。堿解氮、速效磷和速效鉀含量從移栽1年后開始增加，移栽2年含量達到峰值，移栽3、4年再次逐年降低，種植遼細辛的土壤堿解氮含量均顯著高于對照，速效磷和速效鉀含量低于對照土壤。

表1 不同種植年限土壤理化性質(zhì)

2.2 遼細辛不同年限根際土壤細菌和真菌多樣性分析

遼細辛根際土壤16S rDNA測序共獲得381 857條可分類的細菌序列，樣本數(shù)量范圍為59 989～86 192 條；ITS1測序獲得679 865條可分類的真菌序列，樣本數(shù)量范圍在55 475～80 162條。由表2可知，各土壤樣品細菌和真菌測序深度指數(shù)覆蓋率均高于99.1%，表明本次測序能夠較準確地反映樣品中微生物的真實情況。香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)結(jié)果表明，與種植遼細辛的根際土壤相比，對照土壤的細菌和真菌多樣性均較之豐富，可能是由于遼細辛根系對根際土壤微生物的選擇性引起；隨種植年限增加多樣性指數(shù)整體均呈現(xiàn)明顯下降趨勢，連續(xù)種植的遼細辛土壤多樣性各項指數(shù)均顯著低于其他年限土壤，說明連作能降低土壤微生物的多樣性，使土壤微生物群落種類數(shù)量降低且趨于單一化。

表2 遼細辛根際土壤細菌和真菌群落豐富度及多樣性指數(shù)

2.3 遼細辛根際土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 細菌群落結(jié)構(gòu)分析 不同年限遼細辛根際土壤中細菌分屬于36個門、46個綱、96個目、161個科、282個屬。由圖1所示，遼細辛根際土壤中細菌在門水平上具有較高的多樣性，不同年限根際土壤相對豐度排名前十的細菌門分別為：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)。隨著連續(xù)種植年限的增加，變形菌門和擬桿菌門相對豐度明顯增加，放線菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門相對豐度明顯降低。

如圖2所示，不同年限遼細辛根際土壤細菌豐度在屬分類水平上表現(xiàn)出明顯的差異性。與對照相比，移栽4年的根際土壤細菌相對豐度差異性最明顯。移栽4年的優(yōu)勢菌屬有嗜酸菌屬()、節(jié)桿菌屬()、羅河桿菌屬()、褚氏桿菌屬()和屬等；而對照未種植遼細辛土壤中豐度最高的優(yōu)勢菌群為屬、諾卡氏菌屬()、地桿菌屬()等，2個處理的優(yōu)勢菌屬與非優(yōu)勢菌屬呈現(xiàn)相反趨勢。除上述相對豐度變化巨大的菌屬外，一些菌屬在移栽4年后豐度呈現(xiàn)降低趨勢，如芽單胞菌屬()、_屬、鞘氨醇單胞菌屬()、屬、屬、unidentified_Gemmatimonadaceae。

2.3.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析 不同年限遼細辛根際土壤中真菌分屬于14個門、38個綱、81個目、136個科、194個屬。由圖3所示，遼細辛根際土壤中真菌主要分布于：糞殼菌綱(Sordariomycetes)、被孢霉綱(Mortierellomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、Rozellomycotina_cls_Incertae_sedis、微球黑粉菌綱(Microbotryomycetes)等。其中糞殼菌綱為優(yōu)勢真菌菌群，占比分別為XX4(41.12%)>XXCK(29.90%)>XX3(26.51%)>XX5(20.30%)>XX6(9.45%)，在移栽2年時相對豐度占比較對照有所升高，但整體變化趨勢為隨種植年限增加豐度遞減。另一優(yōu)勢真菌菌群被孢霉綱相對豐度占比隨種植年限增加呈現(xiàn)起伏型變化趨勢，XX5(23.37%)>XX3(18.43%)>XXCK(16.21%)>XX4(15.67%)>XX6(6.96%)。而銀耳綱Tremellomycetes則表現(xiàn)為種植年限越長占比越高，XX6(20.83%)遠高于其他年限。

如圖4所示，真菌在屬分類水平上，豐度隨種植年限增加顯著增加，移栽4年的根際土壤到達頂峰的優(yōu)勢菌屬有粘帚霉屬()、土赤殼屬()、白冬孢酵母屬()、假絲酵母菌屬()等。一些菌屬在移栽4年后豐度顯著降低，在未種植遼細辛土壤中豐度優(yōu)勢菌屬有被孢霉屬()、鐮刀菌屬()、屬、圓孢霉屬()、毛殼菌屬()、青霉屬()、屬、屬、籃狀屬()。

2.3.3 真菌群落結(jié)構(gòu)UPGMA 聚類分析 為了研究不同種植年限間土壤真菌群落的相似性，利用Unweighted Unifrac距離矩陣對不同處理真菌群落進行UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類樹。如圖5所示，遼細辛根際土壤真菌的遺傳距離存在一定的差異，未種植遼細辛土壤和XX3遼細辛土壤遺傳距離很近，聚為一類，真菌群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性。XX6遼細辛土壤較其他處理最遠，單獨聚為一類，真菌群落結(jié)構(gòu)與其他處理比較相似性較低。說明隨種植年限增加，遼細辛土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

2.4 土壤理化性質(zhì)與微生物多樣性的相關(guān)分析

如表3、表4所示，遼細辛土壤理化性質(zhì)與根際土壤微生物α多樣性指數(shù)的相關(guān)性分析表明，細菌多樣性指數(shù)與土壤pH值、有機質(zhì)含量、有效磷含量和速效鉀含量呈正相關(guān)；與堿解氮含量呈負相關(guān)，其中與辛普森指數(shù)呈顯著負相關(guān)。真菌多樣性指數(shù)與土壤pH值、有機質(zhì)含量、有效磷含量和速效鉀含量呈正相關(guān)，其中香農(nóng)指數(shù)與速效鉀含量呈顯著正相關(guān)；與堿解氮含量均呈負相關(guān)，其中與香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)達到顯著負相關(guān)。

表3 遼細辛土壤理化性質(zhì)與土壤細菌α多樣性指數(shù)的相關(guān)關(guān)系

表4 遼細辛土壤理化性質(zhì)與土壤真菌α多樣性指數(shù)的相關(guān)關(guān)系

2.5 土壤理化性質(zhì)與微生物優(yōu)勢類群的相關(guān)分析

如表5、表6所示，對不同年限遼細辛根際土壤細菌和真菌優(yōu)勢菌(屬水平)豐度與土壤理化性質(zhì)進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明， 幾乎所有真菌都與堿解氮含量呈負相關(guān)關(guān)系，其中毛殼菌屬和鐮刀菌屬與堿解氮含量有顯著的負相關(guān)性(<0.05)，菌刺孢屬、屬和土赤殼屬與堿解氮含量呈極顯著負相關(guān)性(<0.01)，說明在本研究中堿解氮含量是土壤真菌群落最主要的影響因子。

表5 遼細辛土壤理化性質(zhì)與土壤真菌優(yōu)勢菌(屬水平)的相關(guān)關(guān)系

表6 遼細辛土壤理化性質(zhì)與土壤細菌優(yōu)勢菌(屬水平)的相關(guān)關(guān)系

在土壤細菌優(yōu)勢群落組成與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)分析中發(fā)現(xiàn)，土壤有效磷、速效鉀以及有機質(zhì)含量與遼細辛根際土壤細菌大部分優(yōu)勢菌間表現(xiàn)較強的相關(guān)性，說明土壤有效磷、速效鉀和有機質(zhì)含量是改變土壤細菌群落組成的主控因子。屬與有效磷和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)(<0.05)，屬與有機質(zhì)含量呈顯著負相關(guān)(<0.05)，unidentified_Gemmatimonadaceae與有效磷含量呈顯著負相關(guān)(<0.05)，與有效磷含量呈顯著負相關(guān)(<0.05)，熱酸菌屬與有機質(zhì)含量呈顯著負相關(guān)(<0.05)。

3 結(jié)論與討論

3.1 種植年限對遼細辛根際土壤細菌和真菌群落多樣性的影響

由于多年連續(xù)種植，土壤肥力逐年下降，導致土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，微生物群落多樣性降低，存在潛在的土壤肥力衰退趨勢。土壤微生物群落多樣性是反映土壤健康情況的重要指標，本研究發(fā)現(xiàn)由于遼細辛連續(xù)種植，土壤pH值逐年下降，酸性增加，影響微生物群落多樣性改變。由于逐年施肥，遼細辛種植土壤中堿解氮含量呈先增后降的趨勢，高于未種植遼細辛土壤。這與龍膽草連作和辣椒連作上的研究相一致。種植遼細辛的土壤速效鉀含量表現(xiàn)為低于對照土壤，遼細辛生長消耗鉀元素較多，這與在當歸上的研究結(jié)果相一致。

目前研究認為，土壤pH值能夠影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。對龍膽草連作土壤研究發(fā)現(xiàn)，土壤的pH值隨種植年限增加逐漸降低，且土壤硝化速率與土壤pH值顯著負相關(guān)，說明土壤酸化影響了土壤的氮素循環(huán)過程。枸杞園連作研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比連作土壤堿解氮含量顯著升高，連作影響土壤的硝化和反硝化過程。本研究與上述研究結(jié)論一致，遼細辛土壤pH值隨種植年限增加降低，土壤堿解氮含量逐漸降低，但顯著高于對照土壤。研究結(jié)果表明，遼細辛土壤堿解氮含量與根際土壤細菌辛普森指數(shù)呈顯著負相關(guān)；真菌香農(nóng)指數(shù)與速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)與堿解氮含量呈顯著負相關(guān)。茶園土壤中，氨氧化古菌是酸化土壤中硝化作用的主要驅(qū)動因子，但在遼細辛連續(xù)種植條件下，土壤硝化和反硝化過程以及氮素循環(huán)過程仍需進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)由于遼細辛對磷肥、鉀肥需求量大，土壤中速效磷、速效鉀含量整體均逐年下降，且遠低于對照含量。磷元素是限制植物生長的關(guān)鍵元素，在土壤中多以不溶或者難溶的復雜化合物形式存在，不易被植物吸收利用。土壤解磷微生物，如假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、曲霉素以及青霉素等能夠通過溶解或者礦化過程釋放土壤中的有機磷和無機磷供植物吸收，楊樹連作研究表明，土壤磷含量隨連作時間的加長而逐步降低，且土壤解磷菌的豐度與土壤pH值呈顯著正相關(guān)。本研究表明，連續(xù)種植遼細辛使土壤pH值降低，反而增加了土壤磷的有效性；從解磷微生物相對豐度變化發(fā)現(xiàn)，屬的豐度變化與有效磷含量呈顯著正相關(guān)。在遼細辛的連續(xù)種植模式下，土壤中的磷循環(huán)過程及微生物群落多樣性可能與土壤pH值變化相關(guān)。對于連續(xù)種植遼細辛影響土壤微生物群落功能的變化規(guī)律仍需利用宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組及土壤酶活性等從不同角度進行解析驗證。

3.2 種植年限對遼細辛根際土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受種植作物的影響。連作后，由于根系分泌物積累，土壤微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，細菌和真菌組成和豐度均有差異。在細菌水平上，本研究發(fā)現(xiàn)隨著遼細辛種植年限增加，根際土壤中細菌變形菌門和擬桿菌門相對豐度明顯增加，放線菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門相對豐度明顯降低。苜蓿連作研究有同樣結(jié)果，土壤放線菌門相對豐度顯著高于農(nóng)田土壤，且隨種植年限延長降低。放線菌在纖維素、半纖維素降解以及果膠和木質(zhì)素轉(zhuǎn)化中起最主要的作用，為土壤提供養(yǎng)分且可以分泌多種抗生素類物質(zhì)。同時放線菌還具有解磷作用，其相對豐度對于土壤磷含量具有一定的指示作用，隨著遼細辛種植年限增加，植物自身的生理代謝逐漸減弱，根系生長和活力會有一定程度下降，遼細辛化感作用增強導致土壤中可利用資源下降，進而對微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響。本研究中細菌門水平上，變形菌門相對豐度逐年增加，為最優(yōu)勢菌群，這與苜蓿、枸杞等研究結(jié)果一致。變形細菌能夠利用有機物分解產(chǎn)生的氨氣、甲烷等營養(yǎng)物質(zhì)進行生長代謝活動，變形菌可利用有機碳為土壤提供固氮能力，且對農(nóng)田土壤養(yǎng)分循環(huán)有明顯的促進作用。在細菌屬水平上，有嗜酸菌屬、節(jié)桿菌屬、羅河桿菌屬、褚氏桿菌屬和等優(yōu)勢菌屬，連續(xù)種植處理顯著高于未種植對照處理。而、諾卡氏菌屬、地桿菌屬等優(yōu)勢菌群在對照土壤中豐度最高。預測連作干擾遼細辛與土壤微生物間的互相作用，影響遼細辛根際益生菌和致病菌群間的平衡關(guān)系，但細菌及其豐度變化所導致的生態(tài)系統(tǒng)功能改變?nèi)孕柽M一步研究。

大量研究表明，真菌群落結(jié)構(gòu)受連作影響。在對華中五味子的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著栽培時間增加，優(yōu)勢真菌數(shù)量增加，非優(yōu)勢真菌種數(shù)量逐漸減少直至消失，真菌種類和分布產(chǎn)生顯著差異，進而影響真菌的種群結(jié)構(gòu)和代謝功能多樣性，導致土壤真菌群落多樣性降低，本研究結(jié)果與之相一致，糞殼菌綱為優(yōu)勢真菌菌群，隨年限增加呈現(xiàn)遞減趨勢。另一優(yōu)勢真菌菌群被孢霉綱同樣呈現(xiàn)隨年限增加而降低趨勢。而銀耳綱則表現(xiàn)為種植年限最長占比更高，遠高于其他處理。本研究發(fā)現(xiàn)在連續(xù)種植的根際土壤中達到頂峰的優(yōu)勢菌屬有粘帚霉屬、土赤殼屬、白冬孢酵母屬等。木霉菌為有益菌，一般多存在健康土壤和對照土壤中，本研究木霉菌隨種植年限增加可能是由于種植中不斷施加木霉菌肥的原因。一些菌屬在連續(xù)種植后豐度顯著降低，在未種植遼細辛土壤中豐度優(yōu)勢菌屬有被孢霉屬、鐮刀菌屬、、圓孢霉屬、毛殼菌屬、青霉屬、、、籃狀屬。鐮刀菌為致病菌，會造成中藥材根腐病的發(fā)生。已有研究發(fā)現(xiàn)，土赤殼屬歸屬于子囊菌門的肉座菌目，具有降解腐爛有機質(zhì)，降解纖維素的作用。被孢霉屬作為土壤中的有益菌，起到溶解土壤中磷的作用，此外通過提供氮營養(yǎng)以及提高植物的抗病性，促進植物的生長。屬水平分析結(jié)果表明，隨著遼細辛種植年限的增加，優(yōu)勢真菌一直在變動，其中，鐮刀菌屬、被孢霉屬、毛殼菌屬的生長受到抑制，一定程度上改善了遼細辛根際土壤環(huán)境，提高了土壤的健康水平，促進了遼細辛植株的生長發(fā)育。本研究對土壤真菌群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，隨著遼細辛種植年限增加，土壤性質(zhì)與真菌群落間具有一定的相關(guān)性，其中毛殼菌屬和鐮刀菌屬與堿解氮含量有顯著的負相關(guān)性，菌刺孢屬、和土赤殼與堿解氮含量呈極顯著負相關(guān)，這與在茶樹上的研究結(jié)果類似。土壤中的氮元素等對真菌群落有顯著影響，通過調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分，可以改變根際土壤真菌群落組成和遺傳多樣水平。