響應面法優化黑木耳新品種森盛1號液體發酵條件

解修超， 賈 嬌， 宋 玉， 謝海彬， 鄧百萬， 孫 婭， 徐易潔

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000； 2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中 723000；3.漢中植物研究所，陜西漢中 723000)

黑木耳()作為擔子菌門中重要的藥食同源真菌，含有豐富的氨基酸、多糖、黑色素和維生素等成分，具有增強機體免疫功能、補血、補腦、抗衰老、抗凝血和抑制腫瘤生長等保健效果和藥用功效，是維持人體健康的絕佳食材。近年來，隨著“菌糧”等新名詞的出現，黑木耳在人類健康重要性中的體現越為明顯。

黑木耳作為食藥兩用真菌，在我國的國民經濟、人類健康中展現出巨大的開發前景。從藥用角度來講，主要是黑木耳天然藥物活性成分的提取、分離純化以及相關藥品、保健品的開發等；然而，目前市場上的相關藥品甚少，部分產品只是局限于動物試驗測試。從食用角度來講，我國是世界黑木耳產量最多、食用最多的國家。近年來，黑木耳已成為我國栽培量第二大的食用菌品種，但各個產地生產的黑木耳品質參差不齊，具有優良性狀的黑木耳新品種更是少見。

秦巴山區是我國黑木耳的主要產地之一，其獨特的溫潤氣候條件造就了當地黑木耳“質厚、肉嫩、味美”的品質。黑木耳是秦巴山區主栽食用菌之一，該地區現在的傳統栽培方式相較于近年來發展的液體種栽培技術顯得十分低效，在一定程度上限制了區域產業經濟的發展。研究表明，食用菌液體菌種的生產周期短、菌齡整齊、接種簡便、接種點多、發菌快且不易污染，是解決栽培效率低下的有效途徑之一。目前，有關黑木耳液體發酵工藝的報道甚少，并且由于菌種、培養條件及其優化方法等因素的差異，所得到的液體菌種品質的差別較大。唐業剛采用單因子試驗和正交試驗對毛木耳998菌種液體發酵條件進行優化試驗，所得菌絲轉化量干質量為15.17 g/L。謝意珍等利用正交試驗對黑木耳AU-5菌種液體發酵條件進行優化試驗，所得菌絲轉化量干質量為26.5 g/L。研究表明，相較于正交方法，響應面方法能真實地反映各影響因素間的交互作用，并能得到較好的試驗結果。

本研究以黑木耳新品種森盛1號為試驗材料，在前期研究的基礎上，擬先通過Plackett-Burman試驗從可能影響其菌絲生物量的9個因素[馬鈴薯含量、葡萄糖含量、麥麩含量、蛋白胨含量、磷酸二氫鉀(KHPO)含量、七水硫酸鎂(MgSO·7HO)含量、初始pH值、接種量、溫度]中篩選出顯著性因素；再通過最陡爬坡試驗得到最佳響應區域；最后采用Box-Behnken設計對顯著性因素做響應面試驗，并通過分析和驗證得到最優的液體發酵工藝條件，為黑木耳或其他食用菌的液體菌種生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 森盛1號黑木耳菌株由陜西省食藥用菌工程技術研究中心選育。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖、KHPO、MgSO·7HO等均為分析純，馬鈴薯和麥麩(均為食品級)市購，蛋白胨和瓊脂購自北京百奧萊博科技有限公司，試驗用水為純化水。

1.1.3 主要儀器 LS-B50L型高壓蒸汽滅菌鍋(上海醫用核子儀器廠)、ZHWY-2102C型數顯式恒溫搖床(上海志成有限公司)、TB-214型電子分析天平(北京賽得利斯儀器系統有限公司)、LRH-250-GS型數顯式恒溫培養箱(廣東省醫療器械廠)、101A-3E型電熱鼓風干燥箱(上海試驗儀器廠有限公司)、SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.1.4 培養基 固體培養基(CPDA)：液體母種培養基，為不添加瓊脂的CPDA培養基；基礎發酵培養基：馬鈴薯(去皮)200.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、麥麩10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、KHPO2.0 g/L、MgSO·7HO 1.0 g/L，初始pH值自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化及其液體母種的制備 將森盛1號黑木耳菌株接種于PDA斜面，28 ℃培養至滿管，備用。取0.5 cm大小的斜面菌塊接種于液體母種培養基，靜置24 h后于28 ℃、170 r/min振蕩培養 6 d 備用。

1.2.2 菌絲干質量的測定 抽濾收集菌絲體，純化水洗滌3～5次后，60 ℃烘干至恒質量，電子分析天平稱質量。

1.2.3 Plackett-Burman試驗 根據前期預試驗選定適合森盛1號菌株生長的基礎發酵培養基，并根據培養基組成和發酵條件選取9個因素(馬鈴薯含量、葡萄糖含量、麥麩含量、蛋白胨含量、KHPO含量、MgSO·7HO含量、初始pH值、接種量、溫度)作為研究對象，設計Plackett-Burman試驗，各因素取值見表1。根據各試驗組中不同因素組合配制培養基(每組設置3個重復)，接液體母種并靜置 24 h，振蕩培養8 d后測定菌絲干質量，取平均值，結果借助Minitab 19軟件進行統計分析。

表1 Plackeet-Burman試驗設計各因素及水平

1.2.4 最陡爬坡試驗 根據Plackett-Burman試驗設計中各個顯著影響因素效應的大小，確定對菌絲干質量影響顯著的因素。其中，影響顯著的正效應因素的值逐漸增加，影響顯著的負效應因素的值逐漸減小，設計最陡爬坡試驗方案，使結果逼近最佳響應區域。

1.2.5 Box-Behnken試驗及回歸模型分析 在最陡爬坡試驗基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，采用A(葡萄糖含量)、B(KHPO含量)、C(初始pH值)進行3因素3水平的響應面試驗。試驗因素水平編碼見表2。采用Design-Expert 12.0軟件對Box-Behnken試驗結果進行分析并建立回歸模型，根據模型預測其最佳工藝條件組合。

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表2 3因素3水平Box-Behnken試驗設計

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結果

選用試驗次數=12的 Plackett-Burman試驗設計方案，考察、等9個因素(每個因素取2個水平)對菌絲干質量的影響，結果見表3和表4。

表3 Plackeet-Burman試驗設計及響應值

從表3和表4可以看出，對森盛1號菌絲干質量影響的顯著因素分別是葡萄糖含量()、KHPO含量()、初始pH值()。其中，、增加時，菌絲干質量顯著增加(<0.05)，為正效應因素；而增加時，菌絲生物量顯著降低，為負效應因素。另外，蛋白胨含量、溫度、麥麩含量增加時，菌絲干質量有一定增加，其取值應為高水平(表1)；接種量、馬鈴薯含量、MgSO·7HO含量增加時，菌絲干質量量反而減少(>0.05)，其取值應為低水平(表1)。因此，選取不顯著因素(馬鈴薯200.0 g/L、蛋白胨4.5 g/L、麥麩15.0 g/L、MgSO·7HO 1.0 g/L、溫度28.0 ℃、接種量4%)為發酵工藝的基本參數，將顯著性因素(葡萄糖含量、KHPO含量和初始pH值)作為最陡爬坡試驗的考察對象。

表4 Plackett-Burman試驗分析結果(已編碼單位)

2.2 最陡爬坡試驗結果

響應面擬合只有先逼近最佳響應區域才能最好地反映真實情況，將、逐步增加，逐步減小，最陡爬坡試驗結果詳見表5。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果

從表5可以看出，隨著、逐步增加，以及逐步減小，森盛1號菌絲干質量呈現先增大后減少趨勢。當葡萄糖含量45.0 g/L、KHPO含量 4.5 g/L、pH值4.5時，森盛1號菌絲干質量達到最大(13.1 g/L)。因此，第4組為最佳響應區域，可作為Box-Behnken試驗的考察對象。

2.3 Box-Behnken試驗結果

以A(葡萄糖含量)、B(KHPO含量)和C初始(初始pH值)為考察對象，根據Box-Behnken原理和表2，設計3因素3水平的響應面試驗，考慮各因素間的交互作用對森盛1號菌絲干質量的影響，試驗及分析結果見表6和表7。

表6 Box-Behnken試驗結果

采用Design Expert 12.0軟件對17個試驗點的菌絲干質量()進行回歸統計分析，得出二次模型回歸統計分析表(表7)。

表7 回歸分析結果

=2026+169+242+269+11725-108+0335-4125-3848-3603。

2.4 響應曲面分析

根據回歸方程繪制隨各因素(葡萄糖含量、KHPO含量和初始pH值)變化的響應曲面圖，當響應面圖的坡度越陡峭時，等高線越密集，等高線呈扁圓形時，兩因素交互作用較顯著。由此分析，葡萄糖含量、KHPO含量和初始pH值等3個因素對菌絲干質量的影響(圖1、圖2、圖3)。每個響應曲面分別代表著2個獨立因素間的相互作用，其余因素均保持在編碼水平的0水平。

由圖1可知，A和B的交互作用較顯著；會隨著A和B的增加先增加后降低，其中葡萄糖含量起著主要作用。

由圖2可知，A和C的交互作用較顯著；A和C的值在低水平時，基本不變；A在一定的水平下，隨C的增加，呈緩慢增加趨勢；相比較于C在低水平時，C在高水平時隨A的增加，增加迅速，但最終的仍然比C在高水平時要小。可見，大量葡萄糖的存在在一定程度減少了較高初始pH值對黑木耳菌絲生長的抑制作用。

由圖3可知，B和C的交互作用不顯著，但隨2因素值的增加呈先升高后降低趨勢。

2.5 最佳工藝條件的驗證

綜合以上研究，由回歸模型得到，影響Y的各因素最優值：葡萄糖50.27g/L、KHPO4.93 g/L、初始pH值5.1，此時的最大預測值為21.2 g/L。為了檢驗該工藝的可靠性，采用上述最優條件進行驗證試驗，得到的驗證值為21.57 g/L，與最大預測值(21.2 g/L)非常接近，相對誤差僅為1.75%，小于5%。因此，Box-Behnken響應面法在森盛1號黑木耳液體發酵工藝優化中的應用是成功的。

3 結論與討論

本研究采用Plackett-Burman、最陡爬坡、Box-Behnken響應面以及驗證試驗對森盛1號黑木耳新品種的液體發酵工藝進行了優化，得到了最優的發酵工藝條件：馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖50.27g/L、蛋白胨4.5 g/L、麥麩15.0 g/L、KHPO4.93 g/L、MgSO·7HO 1.0 g/L、初始pH值 5.1、接種量4%、溫度28.0 ℃、160 r/min搖床發酵8 d，菌絲干質量可達到21.57 g/L，比優化前提高了23.53%。

響應面相較于其他優化方法，可以反映碳氮源等因素間的交互作用。與錢雪婷等的研究結論進行比較，與“葡萄糖是影響黑木耳菌絲生物量的顯著性因素”的結論相同，這是由于在發酵初期黑木耳菌株不能產生分解復雜有機物的酶系，而單糖更容易得到吸收利用；與結論“影響黑木耳菌株神農A8干質量順序為KHPO含量>葡萄糖含量>牛肉粉含量”不同，影響菌絲干質量的順序是初始pH值>KHPO含量>葡萄糖含量，可能是由菌種的差異導致；從液體菌種的實際生產來看，較高的菌絲生物量是判斷液體菌種質量的一個重要標準，森盛1號在最優發酵工藝條件下的菌絲干質量比神農A8多94%，可見新品種森盛1號具有更大優勢。

另外，響應面分析得到的二次回歸模型可以較好地反映試驗的真實結果。本研究得到的菌絲干質量驗證值(21.57 g/L)與最大預測值(21.2 g/L)較接近，相對誤差僅為1.75%(<5%)。因此，優化得到的森盛1號黑木耳液體發酵工藝是有效可行的，可為森盛1號新品種及其他黑木耳菌株的液體菌種生產提供科學依據。