2株薏苡內(nèi)生菌促生特性及其對種子萌發(fā)的影響

普鳳雅， 谷書杰， 何永宏， 楊志清，，3

(1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院，云南昆明 650201； 2.云南農(nóng)業(yè)大學云南省藥用植物生物學重點實驗室，云南昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南昆明 650201)

植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)的存在具有普遍性和多樣性的特點，目前研究認為內(nèi)生菌與宿主植物在長期共處中形成了一種復雜、特殊的互利共生關系。植物內(nèi)生菌可以通過提高植物體內(nèi)生長素和分裂素的代謝，促進植物的細胞分裂、根系發(fā)育、幼苗生長，如產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶、吲哚-3-乙酸(IAA)等；還可以提高植物的固氮、溶磷、解鉀作用，以及產(chǎn)生嗜鐵素、羧甲基纖維素酶等促進植物對環(huán)境中有益物質(zhì)的吸收能力。如在缺鐵的土壤環(huán)境中，植物會利用嗜鐵素產(chǎn)生菌產(chǎn)生的鐵載體滿足植物對鐵元素的需要；在逆境下，ACC脫氨酶能夠降低乙烯含量來促進植物生長發(fā)育，緩解植物所受脅迫。Adnan等研究發(fā)現(xiàn)，解磷細菌能夠改善石灰性土壤中作物的生長發(fā)育和對磷元素的吸收。趙青云等的研究表明，接種解磷微生物顯著增加了香草蘭植株干質(zhì)量、土壤有效磷含量；王雪菲的研究表明，解磷細菌能夠提高白菜的農(nóng)藝性狀和生物量；接種解磷細菌和叢枝菌根真菌顯著提高了苜蓿地上生物量、株高、莖粗、粗蛋白含量等。

薏苡(-L.)屬于禾本科(Gramineae)玉蜀黍族(Maydeae)薏苡屬()，是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。目前國內(nèi)外對薏苡促生菌的相關報道較少，篩選薏苡促生菌并研究其促生特性對薏苡生長發(fā)育、薏苡仁產(chǎn)量、品質(zhì)、有效活性成分積累有一定的幫助，對推動薏苡產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本研究以前期分離得到的2株薏苡內(nèi)生菌為研究對象，通過測定2株薏苡內(nèi)生菌分泌嗜鐵素、羧甲基纖維素酶、ACC脫氨酶的能力，探究這2株內(nèi)生菌促進作物生長的生理機制；通過種子萌發(fā)試驗評價2株薏苡內(nèi)生菌及其混合菌液對薏苡種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，同時也探究薏苡促生菌對禾本科作物(玉米、水稻、大麥、小麥)種子萌發(fā)和幼苗生長的影響；以期為穩(wěn)定薏苡產(chǎn)量、減少化肥施用以及為后期薏苡生物菌肥的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 本試驗于2019年12月在云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院云南省高校作物種質(zhì)創(chuàng)新及可持續(xù)利用重點實驗室進行。所需菌株由云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點實驗室分離保存，編號為L21的菌株分離自文薏2號葉片，經(jīng)筆者所在課題組鑒定為貝萊斯芽孢桿菌()，編號為R24的菌株分離自文薏2號根部，經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌()。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉 5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基在此基礎上加入17 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

鉻天青(CAS)鐵載體檢測培養(yǎng)基、MKB培養(yǎng)基、DF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)基按照劉璐的方法進行配制；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基按照吳靜的方法進行配制。

1.1.3 供試作物品種 玉米：點谷1號；水稻：滇禾優(yōu)55，大麥：北青7號，小麥：云麥53；以上品種均由云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點實驗室提供。薏苡：文薏2號和師薏1號，由云南省文山州農(nóng)科院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株產(chǎn)嗜鐵素能力的定性和定量分析 (1)定性檢測。將內(nèi)生菌菌株點接種至鉻天青固體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，出現(xiàn)透明圈即說明菌株產(chǎn)生嗜鐵素。計算可溶性指數(shù)：可溶性指數(shù)=，其中：代表透明圈直徑，代表菌落直徑。(2)定量測定。將菌液接種于液體 MKB培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、36、48、60、72 h后取上清液5 mL，5 000 r/min 離心10 min，保留嗜鐵素發(fā)酵上清液(SCS)，將嗜鐵素發(fā)酵上清液(3 mL)和CAS(3 mL)溶液以1 ∶1的體積比混合均勻，暗反應 1 h，用分光光度計測反應液在 630 nm 處的吸光度，記為。取3 mL未接種MKB液體加入等體積的 CAS 檢測液，其余操作相同，吸光度記為。

1.2.2 菌株產(chǎn)羧甲基纖維素酶能力的定性和定量分析 定性檢測：將內(nèi)生菌菌株點接種至纖維素酶鑒別培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，加入剛果紅溶液，再加入氯化鈉溶液脫色。觀察菌落周圍是否產(chǎn)生纖維素水解圈，產(chǎn)生纖維素水解圈則說明菌株可產(chǎn)生纖維素酶。

定量測定：將產(chǎn)生纖維素酶的菌株接種至纖維素酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、36、48、60、72、84 h后取上清液5 mL，5 000 r/min 離心10 min，采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定菌株的纖維素酶活性和濾紙酶活性。

1.2.3 ACC脫氨酶活性的測定 將供試菌株在液體LB培養(yǎng)基中活化過夜，4 ℃、8 000 r/min離心 10 min，用無菌水收集菌體沉淀并將其重新懸浮于ADF培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜后按照秦寶軍等的方法測定ACC脫氨酶的活性。

1.2.4 菌株對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響 菌液準備：將供試菌株接種于液體LB培養(yǎng)基中，35 ℃過夜培養(yǎng)，4 ℃、8 000 r/min離心收集沉淀，無菌水重懸，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×10CFU/mL備用。T1處理：濃度為 1×10CFU/mL的L21菌液；T2處理：濃度為1×10CFU/mL 的R24菌液；T3處理：濃度為1×10CFU/mL的L21和R24等比例復配的菌液；以無菌水處理作為對照(CK)。

將所供試的種子用75%乙醇溶液消毒10 min，用無菌水洗凈，晾干后置于以上菌液中浸種4 h，待風干后再放置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃條件下進行培養(yǎng)，定時檢查濕度，確保濾紙潮濕。定時記錄種子的萌發(fā)數(shù)(以胚根突破種皮1 mm為標準)，直至第10天。第4天計算發(fā)芽勢，第10天計算發(fā)芽率，并測定作物的鮮質(zhì)量、芽長、根長、根系活力(用2，3，5-氯化三苯基四氮唑法測定)。

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢=(4 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)()=∑/，其中：為每天的發(fā)芽數(shù)，為發(fā)芽天數(shù)；

活力指數(shù)()=×，其中：為平均幼苗長度(芽長+根長)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2010 和SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行記錄、整理、統(tǒng)計和分析；對不同菌株處理的小組進行組間單因素方差分析比較。

2 結果與分析

2.1 菌株嗜鐵素合成能力測定結果

2.1.1 定性測定結果 從圖1中可看出，2株內(nèi)生菌在CAS檢測平板上均可以生長并產(chǎn)生透明圈，R24菌株的透明圈大于L21菌株。可溶性指數(shù)可初步判斷菌株產(chǎn)嗜鐵素的能力，該值越大其分泌的鐵載體在培養(yǎng)基中的分布范圍越大，即其在相同培養(yǎng)條件和時間下產(chǎn)生鐵載體的能力越強。本研究中2株供試菌株可溶性指數(shù)均在1.5以上，可溶性指數(shù)表現(xiàn)為R24菌株>L21菌株(表1)。

表1 嗜鐵素合成能力定性測定結果

2.1.2 定量測定結果 由圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌株分泌嗜鐵素的能力逐漸增強，培養(yǎng)到60 h時R24和L21菌株分泌嗜鐵素的能力最強，嗜鐵素相對含量分別為95.80%、90.08%。在整個培養(yǎng)過程中，R24菌株分泌的嗜鐵素相對含量均大于L21菌株，這與“2.1.1”節(jié)中的結果一致。

2.2 羧甲基纖維素酶活性和濾紙酶活性測定

2.2.1 定性測定結果 2株菌株均能在羧甲基纖維素酶鑒別培養(yǎng)基中形成纖維素水解圈(圖3)，說明2株菌都能產(chǎn)生羧甲基纖維素酶。可溶性指數(shù)越大表明菌對纖維素的降解能力越強，由表2可知，菌株R24的可溶性指數(shù)為5.29，L21的可溶性指數(shù)為5.11，降解纖維素酶的能力表現(xiàn)為R24菌株>L21菌株。

表2 羧甲基纖維素酶定性檢測結果

2.2.2 定量測定結果 將菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、36、48、60、72、84 h后上清液的纖維素酶活性和濾紙酶活性測定結果如圖4和圖5所示；隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株的羧甲基纖維素酶活性和濾紙酶活性呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在培養(yǎng)72 h后R24和L21菌株的羧甲基纖維素酶活性和濾紙酶活性均達到最大值，分別為0.28、0.61 U/mL和0.86、1.43 U/mL。2株菌的羧甲基纖維素酶活性均低于濾紙酶活性，菌株L21的羧甲基纖維素酶活性和濾紙酶活性均高于菌株R24。

2.3 ACC脫氨酶含量測定結果

將菌株在ADF培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過夜后棄上清液收集菌體，測得ACC脫氨酶活性如圖6所示，ACC脫氨酶酶活性表現(xiàn)為L21菌株>R24菌株，其ACC脫氨酶活性分別為2.30、2.00 μmol/(μg·h)。

2.4 菌株對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.4.1 不同處理對種子萌發(fā)的影響 由表3可知，T1、T2、T3處理均能提高薏苡、玉米、水稻、大麥、小麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，其中，處理效果最佳的是T1處理，T2處理次之。在T1處理下，文薏2號、師薏1號、滇禾優(yōu)55、云麥53的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與CK相比差異均達到極顯著水平(<0.01)；點谷1號的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)和北青7號的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與CK相比差異也達到極顯著水平(<0.01)。T1處理下文薏2號和師薏1號的發(fā)芽率分別為95.56%、84.44%，較無菌水處理分別增加了13.16%、28.80%；發(fā)芽勢分別為82.22%、76.67%，較CK分別增加了19.35%、25.46%；發(fā)芽指數(shù)分別為43.69%、41.81%，較CK分別增加24.30%、34.09%；活力指數(shù)分別為17.03、15.63，較CK分別增加160.80%、84.32%。

表3 不同處理對種子萌發(fā)的影響

2.4.2 不同處理對作物根系生長的影響 由圖7可知，T1、T2、T3處理均能夠促進薏苡、玉米、水稻、大麥、小麥的根系生長，T1處理下，所有供試材料的根系生長與CK相比差異都達到極顯著水平(<0.01)，其中，效果最佳的是文薏2號，其根長較CK增加了292.85%。T2處理下，文薏2號、師薏1號、滇禾優(yōu)55、云麥53和北青7號的根長與CK相比差異達到極顯著水平(<0.01)，點谷1號的根長與CK相比差異達到顯著水平(<0.05)。T3處理下，師薏1號的根長較CK增加了22.08%，并與CK相比差異達到極顯著水平(<0.01)；文薏2號和云麥53的根長與CK相比差異達到顯著水平(<0.05)；點谷1號、滇禾優(yōu)55、北青7號的根長分別比CK增加了8.05%、8.89%、55.56%，但是與CK相比差異均未達到顯著水平。

2.4.3 不同處理對作物芽長的影響 由圖8可知，T1、T2、T3處理均提升了供試作物芽的生長，處理效果表現(xiàn)為T1處理>T2處理>T3處理。除北青7號外其余供試材料在T1和T2處理下與CK相比差異均達到極顯著水平(<0.01)。在T3處理下，師薏1號和云麥53的芽長與CK相比差異達到極顯著水平(<0.01)；點谷1號和滇禾優(yōu)55的芽長與CK相比差異達到顯著水平(<0.05)；文薏2號和北青7號的芽長分別比CK增加了3.81%和3.41%，但差異未達到顯著水平。不同處理下幼苗的生長狀態(tài)詳見圖9。

2.4.4 不同處理對作物鮮質(zhì)量的影響 由圖10可知，T1、T2、T3處理能夠促進作物的生長發(fā)育，增加供試作物的鮮質(zhì)量。在T1處理下，所有供試作物的鮮質(zhì)量與CK相比差異均達到極顯著水平(<0.01)。在T2處理下，文薏2號、師薏1號和點谷1號的鮮質(zhì)量與CK相比差異均達到顯著水平(<0.05)，滇禾優(yōu)55、云麥53和北青7號的鮮質(zhì)量與CK相比差異均達到極顯著水平(<0.01)。在T3處理下，點谷1號和云麥53的鮮質(zhì)量與CK相比差異均達到顯著水平，文薏2號、師薏1號、滇禾優(yōu)55和北青7號的鮮質(zhì)量分別顯著較CK增加了3.44%、10.76%、10.89%、6.00%，但差異均未達到顯著水平。

2.4.5 不同處理對作物根系活力的影響 由圖11可知，T1、T2、T3處理均能夠提高供試作物的根系活力。在T1和T2處理下，所有供試材料的根系活力與CK相比差異均達到極顯著水平(<0.01)；在T1和T2處理下，文薏2號的根系活力較CK分別增加了205.04%和171.35%。在T3處理下，除了云麥53，其余供試材料的根系活力與CK相比差異均達到極顯著水平(<0.01)。

3 討論與結論

植物促生菌能夠有效提高植物對土壤養(yǎng)分的吸收利用、改善土壤耕層環(huán)境以及田間生態(tài)環(huán)境，還能通過自身作用或者產(chǎn)生代謝產(chǎn)物來緩解逆境對植物的傷害，從而來促進植物生長，在作物生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境方面都具有一定的潛能。本研究利用L21和R24這2株薏苡內(nèi)生菌來探究其促生長的特性，結果表明，2株薏苡內(nèi)生菌均能夠產(chǎn)生嗜鐵素、ACC脫氨酶和羧甲基纖維素酶。在本研究中，產(chǎn)生嗜鐵素能力最強的是分離自文薏2號根系的R24菌株，搖瓶60 h后嗜鐵素相對含量為95.80%，高于吳娟麗等在土壤中分離得到的E7和W7菌株的嗜鐵素相對含量，但是菌株產(chǎn)生的嗜鐵素的種類需要進一步研究。梁燁等的研究表明，接種含ACC脫氨酶的根際促生細菌后，在各種鹽堿處理條件下，大豆地上部和根系的干質(zhì)量均增加。本研究中，2株薏苡內(nèi)生菌L21和R24菌株的ACC脫氨酶活性為2.30、2.00 μmol/(μg·h)。促生菌株可以通過利用能夠降解纖維素的微生物，把秸稈降解為腐殖質(zhì)物質(zhì)，增加土壤肥力，從而促進作物生長。在本研究中，2株菌中產(chǎn)生羧甲基纖維素酶和濾紙酶能力最強的是分離自文薏2號葉片的菌株L21，其活性分別為0.61、1.43 U/mL，2株菌的羧甲基纖維素酶活性均低于濾紙酶活性。在篩選羧甲基纖維素酶高產(chǎn)菌株的過程中發(fā)現(xiàn)，在定性篩選培養(yǎng)基平板上水解圈較大的菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后測得的酶活性不高，其原因可能是篩選所用的固體培養(yǎng)基和發(fā)酵所用的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件不同；另外，篩選培養(yǎng)基的厚度和菌落菌體量的差異也會影響水解圈的大小。

韓麗珍等的研究結果表明，HGD12溶磷菌株顯著促進了辣椒和花生種子的萌發(fā)，對辣椒和花生幼苗植株的鮮質(zhì)量、株高及根長均有顯著的促生作用。汪焱等的研究結果表明，促生菌對植物種子的萌發(fā)和幼苗的生長具有一定的促進作用；蔡紅丹等的研究結果表明，用溶磷細菌處理過的水稻種子出苗速度、出苗整齊度和發(fā)芽率最好。本研究通過種子萌發(fā)試驗探究了2株薏苡內(nèi)生菌及其混合菌液對其宿主植物薏苡以及其他禾本科作物(玉米、水稻、大麥、小麥)種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。結果表明，L21、R24菌株均能顯著提高宿主植物薏苡以及玉米、水稻、大麥、小麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根系活力以及幼苗生長；其中，經(jīng)L21和R24菌株處理的文薏2號的根長較無菌水處理分別增加了292.85%和260.71%，說明菌株L21和R24具有極強的促生長能力，主要表現(xiàn)在促進其根系的生長發(fā)育，且L21菌株的效果更佳；L21和R24菌株的等比例混合菌液與CK相比，在種子萌發(fā)和幼苗生長方面促進效果顯著，但是低于L21和R24菌株單獨處理的效果，可能的原因是2株菌在營養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位等方面有競爭關系。綜上可知，L21和R24菌株能顯著促進作物苗期生長發(fā)育，可作為后續(xù)研制生物菌肥的優(yōu)良菌株資源。本研究結果為薏苡減肥增效提供了理論依據(jù)和基礎，對推動薏苡產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。