無毒性產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素重組蛋白的自誘導(dǎo)分泌表達(dá)及免疫原性分析

魏后軍， 范志宇， 胡 波， 仇汝龍， 陳萌萌， 宋艷華， 徐為中， 王 芳

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014)

產(chǎn)氣莢膜梭菌()也稱魏氏梭菌，是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥、人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一。該菌的致病因子是其分泌的外毒素，主要是、、和毒素，據(jù)此將該菌分為A、B、C、D、E等5個(gè)毒素型；各毒素型均產(chǎn)生毒素，毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的毒力因子，其中A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌毒素最多。毒素基因位于染色體上，大小為1 194 bp，編碼的產(chǎn)物由398 個(gè)氨基酸殘基組成，其中前28 個(gè)氨基酸為信號肽，成熟肽為 370 個(gè)氨基酸。毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶2種酶活性，能同時(shí)水解細(xì)胞膜上的磷脂酰膽堿和鞘磷脂，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，因而具有細(xì)胞毒性、溶血活性和血小板聚集等特性。因此，研究者利用基因工程技術(shù)將毒素去毒性，作為抗原研制疫苗。

Studier提出了外源基因表達(dá)自誘導(dǎo)(auto-induction)的方法。其原理是大腸桿菌首先以葡萄糖為碳源生長，葡萄糖消耗殆盡，達(dá)到一定活力后，開始消耗培養(yǎng)基中的乳糖，在乳糖滲透酶(lactose permease)和-半乳糖苷酶(-galactosidase)的作用下，乳糖穿過細(xì)胞膜并部分轉(zhuǎn)化為異乳糖開啟了T7表達(dá)系統(tǒng)，乳糖的代謝產(chǎn)物葡萄糖和半乳糖也可作為碳源。與IPTG(isopropyl--thiogalactoside)相比，乳糖無細(xì)胞毒性、價(jià)格較低，自誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)劑，無需在培養(yǎng)過程中檢測重組菌的生長情況添加誘導(dǎo)劑。

本研究對含信號肽的毒素基因進(jìn)行突變?nèi)ザ炯懊艽a子優(yōu)化，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)自誘導(dǎo)分泌表達(dá)了無毒的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素重組蛋白，該方法具有安全、抗原免疫原性好、工藝簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，研制的疫苗能有效避免現(xiàn)有疫苗生產(chǎn)工藝較復(fù)雜、成本較高等問題。本研究為研制產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因工程疫苗提供了技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存；兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)滅活疫苗購自山東華宏生物工程有限公司，主要成分為滅活的蘇84-A株全菌液，用量為2 mL/只；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；高保真酶購自 Invitrogen 公司；凝膠回收純化試劑盒購自TaKaRa公司；大腸桿菌() BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購自上海翊圣生物科技有限公司；A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)在肉肝胃膜湯中培養(yǎng)的濾液(16～20 g小鼠的毒素含量為50 MLD/mL)，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備、保存；A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的兔源多克隆抗體由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備、保存；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；自誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L 甘油、0.25 g/L 葡萄糖、25 mmol/L NaHPO、25 mmol/L KHPO、50 mmol/L NHCl、5 mmol/L NaSO、2 mmol/L MgSO、1 g/L乳糖。

1.2 α毒素基因序列的測定

根據(jù)GenBank上公布的α毒素基因序列(GenBank：AY823400.1)設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-G C G G A A T T C A T G A A A A G A A A G A T T T G T A A G-3′，下游引物：5′-G C G C T C G A G T T A T T T T A T A T T A T A A G T T G-3′，由南京擎科生物科技有限公司合成。以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)DNA為模板，PCR反應(yīng)體系：模板1 μL，高保真酶0.2 μL，10×Buffer 5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL，dNTPs(25 mmol/L)4 μL，MgSO(50 mmol/L)2 μL，ddHO 37 μL；反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，62.0 ℃ 1 min，68 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收目的片段。回收的目的片段測序，獲得毒素基因序列(蘇84-A株)。

1.3 重組菌的構(gòu)建

根據(jù)毒素測序結(jié)果，將毒素的第176位組氨酸(CAT)突變?yōu)樘於０?AAT)，同時(shí)對信號肽序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化；將化學(xué)合成的該序列插入到載體pET32a(RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)之間)，獲得重組質(zhì)粒pET32a-αH176N。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的抗性LB平板，37℃靜置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的抗性LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振搖過夜，菌液經(jīng)PCR鑒定陽性，將該菌株命名為大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株。

1.4 重組蛋白的表達(dá)、鑒定

將大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1%接種于含氨芐青霉素的抗性自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28 ℃振搖培養(yǎng)24 h后，6 000 r/min 離心15 min，收集上清，經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾后，獲得重組蛋白αH176N，在αH176N蛋白及100、50、25 μg/mL 的BSA中分別加入4×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸 5～8 min，進(jìn)行SDS-PAGE分析；同時(shí)以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的兔源多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，對αH176N蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。

1.5 自誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

將大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1%接種于含1、2、4 g/L乳糖的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個(gè)乳糖濃度的培養(yǎng)基分別在16、28、37 ℃振搖培養(yǎng)24 h后，6 000 r/min 離心15 min，收集上清，經(jīng) 0.22 μm 孔徑濾膜過濾后，分別加入4×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸5～8 min，進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.6 重組蛋白的毒性測定

1.6.1 卵磷脂酶活性試驗(yàn)毒素具有磷脂酶C活性，能將卵黃中的磷酸卵磷脂特異性的水解成磷酰膽堿和1，2-甘油二脂，產(chǎn)生白色混濁。將αH176N蛋白和野生型毒素，分別滴加2 μL到卵黃瓊脂平板，37 ℃靜置1 h后，觀察滴加的位置是否出現(xiàn)白色混濁斑。

1.6.2 小鼠毒力試驗(yàn) 10只16～20 g小鼠，隨機(jī)分成2組，每組5只。其中1組作為對照組，將空載體大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a自誘導(dǎo)的全菌液，離心后取上清，經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜的濾液，尾靜脈注射小鼠0.3 mL/只；另1組小鼠，尾靜脈注射αH176N蛋白液0.3 mL/只，連續(xù)觀察7 d。

1.7 與滅活疫苗效力試驗(yàn)比較

將制備的αH176N蛋白(62.4 μg/mL)，與氫氧化鋁膠按9 ∶1的比例加入氫氧化鋁膠佐劑，作為本次試驗(yàn)用基因工程疫苗；將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)在肉肝胃膜湯中培養(yǎng)的濾液(16～20 g小鼠的毒素含量為50 MLD/mL)，用甲醛滅活后與氫氧化鋁膠按9 ∶1的比例加入氫氧化鋁膠佐劑，作為本次試驗(yàn)用自制類毒素疫苗。分別將基因工程疫苗(1、0.25、0.125 mL)、自制類毒素疫苗(2、1 mL)、商品化疫苗(2 mL)免疫1.5～2.0 kg健康易感家兔，每個(gè)劑量組各6只，21 d后，連同6只對照組，耳緣靜脈注射1 MLD的 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，連續(xù)觀察3～5 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 α毒素基因序列的測定

以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明：擴(kuò)增出約1 200 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。回收目的片段，測序獲得α毒素基因序列。

2.2 重組αH176N蛋白的表達(dá)與鑒定

大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，SDS-PAGE電泳分析顯示，蛋白分泌到培養(yǎng)基中 (圖2-A)，通過QuantiyOne軟件，計(jì)算蛋白含量為50.1 μg/mL。Western blot結(jié)果顯示，αH176N蛋白有約42.5 ku大小的目的條帶，空載體大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a經(jīng)誘導(dǎo)的全菌液無條帶，表明目的蛋白已得到分泌表達(dá)。

2.3 自誘導(dǎo)條件的優(yōu)化結(jié)果

將大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1%接種于含1、2、4 g/L乳糖的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個(gè)乳糖濃度的培養(yǎng)基分別在16、28、37 ℃振搖培養(yǎng)24 h后，收獲蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析，在含1～2 g/L 乳糖的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基及28 ℃誘導(dǎo)條件下，可以獲得較多分泌表達(dá)的目的蛋白(圖3)。

2.4 重組αH176N蛋白的毒性

野生型α毒素在卵黃瓊脂平板上出現(xiàn)白色混濁斑，而αH176N蛋白不出現(xiàn)白色混濁斑，說明αH176N蛋白已不具備毒素的磷脂酶C活性。將αH176N蛋白尾靜脈注射小鼠，觀察期內(nèi)，連同對照組小鼠均健活且無不良反應(yīng)，說明重組蛋白αH176N是無毒的。

2.5 免疫保護(hù)試驗(yàn)

分別將基因工程疫苗、自制類毒素疫苗、商品化疫苗免疫試驗(yàn)兔，21 d后攻毒，結(jié)果顯示，基因工程疫苗0.25 mL/只免疫保護(hù)效果優(yōu)于類毒素疫苗 2 mL/只 及商品化疫苗2 mL/只的免疫保護(hù)效果(表1)。

表1 免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前商品化的產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗是將厭氧培養(yǎng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液或外毒素滅活制備而成，存在抗原成分復(fù)雜、穩(wěn)定性差、副作用大以及滅活不徹底等安全隱患問題。而有關(guān)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因工程疫苗的研究大多采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、以截短表達(dá)或多點(diǎn)突變的方法使毒素去毒性。毒素蛋白通常在胞內(nèi)以不可溶性的包涵體或胞內(nèi)的可溶性蛋白表達(dá)。包涵體形式表達(dá)影響了毒素的天然結(jié)構(gòu)，使其失去生物活性，需進(jìn)行復(fù)性處理；胞內(nèi)的可溶性蛋白具有生物活性，但含雜蛋白較多，需進(jìn)行復(fù)雜的純化過程；且重組大腸桿菌采用IPTG作為誘導(dǎo)劑，需要依據(jù)檢測重組菌的生長情況添加誘導(dǎo)劑。

本研究通過基因工程技術(shù)突變毒素蛋白的1個(gè)氨基酸，使其失去毒性，同時(shí)保留其天然結(jié)構(gòu)和分子特征。此外，本研究采用自誘導(dǎo)分泌表達(dá)技術(shù)，以培養(yǎng)基中天然成分乳糖作為誘導(dǎo)劑，并對信號肽序列進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)重組毒素“胞外分泌”，直接以可溶的形式分泌釋放到培養(yǎng)基中，無需添加化學(xué)誘導(dǎo)劑。將制備的αH176N蛋白液與氫氧化鋁膠配制成的疫苗，免疫0.25 mL/只就能達(dá)到100%(6/6)保護(hù)的效果，且具有抗原成分單一、安全性好、工藝簡單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，可為多聯(lián)苗、多價(jià)苗的研究奠定基礎(chǔ)。