腫瘤患者糞菌移植偏好調查及其腸道菌群組成特征分析

李明霞，楊與珍，岳志瑛，李俊英，鄭儒君

(1.四川大學華西醫院 a.胸部腫瘤科，b.生物研究治療病房，四川 成都 610041；2.四川大學華西護理學院，四川 成都 610041)

糞菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)是指從健康供體的糞便中提取功能菌群移植到患者腸道，以達到治療疾病的目的[1, 2]。人體胃腸道內生存著一千多種微生物，維持人體微環境的平衡,參與調節免疫、新陳代謝、細胞反應等生理功能[3]。越來越多的研究表明腸道菌群可以促進免疫治療功效，影響放療、化療的療效及相關不良反應的發生[4,5]，對腫瘤患者有利。除此以外，研究還發現補充乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌與減少抑郁癥的發生有關[6],可見腸道菌群組成甚至能影響情緒、認知和心理健康。已有研究發現FMT可以治愈抑郁癥，且無明顯不良反應[7]，從而提示了FMT或將成為一種有效的嶄新的腫瘤治療方法[4, 8]。但至今我們卻處于了解腸道菌群作用機制復雜性的早期階段[9]，關于患者對FMT偏好的相關研究極少，并且腫瘤患者腸道菌群的組成特征與患者心理健康有何關聯更待進一步研究和探索。研究表明，心理痛苦與焦慮、抑郁、恐懼等負性情緒密切相關[10]，已成為第6大生命體征，可反應腫瘤患者的心理健康狀態。基于以上，本研究旨在通過問卷調查腫瘤患者是否愿意選擇FMT，探究他們對FMT的態度和偏好及影響因素，并將心理痛苦作為反映腫瘤患者心理健康的指標，通過16S rRNA高通量測序技術檢測有無心理痛苦的腫瘤患者腸道菌群的組成特征及結構差異, 以期為今后的臨床實踐及機制研究提供重要參考和循證依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用便利抽樣的方法，選擇2018年9月1日至2018年9月30日四川大學華西醫院收治的120例腫瘤患者作為研究對象。納入標準：①通過病理學診斷為惡性腫瘤；②年齡≥18歲；③生存時間≥3個月，了解疾病進展；④能夠讀寫中文。排除標準：①處于危急狀態；②有認知障礙或精神病；③由于各種原因未能完成問卷，導致數據丟失。本研究符合赫爾辛基宣言。在知情同意后由研究者對研究對象進行問卷調查。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料調查表 采用自行設計的調查問卷以評估腫瘤患者對FMT的態度和偏好。問卷包括調查患者一般資料和臨床指標的10個問題(性別、年齡、教育程度、醫保類型、腫瘤分期、美國東部腫瘤協作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)體力狀況(performance status，PS)評分和直接與FMT相關的3個問題(患者對FMT的意愿、供體、途徑的偏好)[11, 12]。

1.2.2心理痛苦溫度計(Distress Thermometer,DT)

采用DT對研究對象進行評估，并根據結果將其分為有心理痛苦組和無心理痛苦組。DT的評估方法為視覺評分法，0分表示沒有痛苦，10分表示極度痛苦，患者在0～10之間評分，當DT≥4分即存在顯著心理痛苦。DT臨界值取4分時敏感度和特異度分別為0.82和0.73, 具有良好的信效度[7]。本研究無心理痛苦6例患者(評分1～3)，有心理痛苦5例患者(評分4～8)，共11例患者同意研究者收集自己的糞便樣本做高通量測序。

1.2.316S rRNA高通量測序技術 采用16S rRNA高通量測序技術對樣本腸道菌群進行群落組成分析和差異物種分析。

1.3 數據收集本研究結合了橫斷面調查和基礎實驗研究。研究者使用統一的指導語告知患者研究目的，并向他們解釋糞菌移植的概念、目的和意義，之后進行調查。研究者僅僅記錄患者的回答，不能試圖影響或引導患者的立場和觀點。本次調查收回有效問卷101份(回收率84.2%)。

詢問患者是否愿意將糞便送檢，征得同意之后由一名研究者收集糞便,置于滅菌凍存管中,液氮凍存,隨后轉置于-80 ℃冰箱保存。使用脫氧核糖核酸(DNA)試劑盒進行基因組DNA 抽提后，電泳檢測DNA。通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增獲得16S rDNA基因V4標簽片段，選擇Illumina公司構建平臺文庫，并于Illumina平臺進行高通量測序。研究中的所有數據都將嚴格保密，并且只作研究使用。

1.4 統計學方法應用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析。用Kruskal-Wallis檢驗推斷不同人口學特征的患者對FMT供體、移植途徑的偏好的差異。Logistic二元回歸分析與FMT意愿有關的影響因素。使用定量分析微生物生態學(quantitative insights into microbial ecology,QIIME)軟件將操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)的代表序列與SILVA數據庫進行比對注釋；根據OTU分析結果，進行群落組成分析和差異物種分析。統計和作圖主要使用R6、python和java軟件完成。采用機器學習中的隨機森林法對菌群組成差異進行比對分析，找出差異性菌屬。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料本研究納入了符合標準的101例腫瘤患者，平均年齡為53.6歲(20～81歲)，大多數患者(99例)的腫瘤分期是Ⅱ～Ⅳ期。研究對象的一般資料見表1。

表1 101例患者一般資料 [n(%)]

2.2 患者對FMT意愿的影響因素分析101例患者中92例(91.1%)表示愿意選擇FMT，9例(8.9%)沒有選擇。Logistic多元回歸分析顯示，文化水平和腫瘤分期是FMT意愿的影響因素，見表2。患者年齡、性別、民族、宗教、醫療保險、婚姻狀況、生活狀況、原發腫瘤部位、收入和體力狀況評分等因素與是否接受FMT無關(P>0.05)。

表2 患者對FMT意愿的影響因素分析

2.3 患者對FMT供體的選擇Kruskal-Wallis檢驗表明，不同年齡和不同文化水平的腫瘤患者在選擇FMT供體的偏好上差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。老年患者更希望接受陌生人的糞菌，初中或初中以下文化程度的腫瘤患者更傾向于接受親屬的糞便進行FMT。

表3 不同人口學特征腫瘤患者FMT供體偏好的差異 (n)

2.4 患者對FMT途徑的選擇Kruskal-Wallis檢驗結果表明，不同性別和不同PS評分的患者在選擇FMT移植途徑方面差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。 PS評分較低的腫瘤患者表明更愿意通過口服的途徑進行FMT。同時，較高比例的女性患者也愿意采取口服的方式來完成FMT。

表4 不同人口學特征腫瘤患者FMT途徑偏好的差異 (n)

2.5 腫瘤患者腸道細菌群落組成的差異高通量測序技術分析顯示：心理痛苦組(Con)變形菌門的豐度明顯高于無心理痛苦組(Dis)，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度明顯低于無心理痛苦組(圖1a)。在屬水平上，心理痛苦組擬桿菌豐度低于無心理痛苦組(圖1b)。機器學習中的隨機森林分析顯示，兩組患者的糞便樣本中Flavonifractor菌、Akkermansia菌、Anaeroglobus菌、Lachnoclostridium菌、Tyzzerella-3菌的豐度比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

圖1 無心理痛苦腫瘤患者與有心理痛苦腫瘤患者糞便微生物群優勢菌群的相對豐度 a:患者糞便微生物群在門分類級別的豐度；b:屬分類水平高豐度微生物群桑基圖

表5 無心理痛苦組與有心理痛苦組糞便微生物群優勢菌群屬分類水平豐度比較

3 討論

腸道菌群已成為當今醫學與生命科學研究的熱點領域，基于FMT的潛在治療前景，本研究調查了腫瘤患者對于FMT的意愿、供體、途徑的態度和偏好，研究結果有一定臨床價值。國外一項隨訪研究表明，97%的復發性艱難梭菌感染患者較抗生素而言更喜歡FMT[11]。Jalanka等[12]研究報告也與我們的結果相似，本研究表明91.1%的腫瘤患者愿意選擇FMT作為腫瘤治療的一個可選方案。腫瘤患者對糞菌移植的態度是積極的，當未來FMT療法成為一種新的惡性腫瘤輔助治療方法時，能被患者接受。醫護人員應根據患者的文化水平進行個體化的指導，有助于患者理解和接受FMT。

FMT的供體包括配偶、直系親屬、其他家庭成員、朋友或伴侶以及陌生人[11]。盡管患者與直系親屬和/或配偶有共同的遺傳背景和生活習慣，但在未患病的親屬的腸道菌群中沒有觀察到與患者一致的特征，因此受者和供體之間的親密關系不會影響FMT的效果[13]。在我們的研究中，腫瘤患者更喜歡選擇配偶和親屬作為供體，比例占65.2%。這是因為配偶和親屬作為家屬，與患者形成了一種持久的情感聯系，是患者認為的能夠給予自己安全感的特定對象[14]，所以患者更愿意選擇他們。本研究發現，隨著年齡的增長和文化水平的提高，選擇陌生人作為其供體的患者比例也有所增加，這與他們的閱歷和知識儲備有關。糞菌移植作為一項新型的“器官移植”，涉及到供體的選擇和篩查，而隨著糞便銀行和糞菌庫逐步建立，供體的糞便樣本逐漸增多[15]，患者可能在陌生人中篩選到更合適的供體。因此，不論患者偏好的供體是什么身份，更重要的是供體的菌群是否合格。

國內外研究顯示，可通過保留灌腸、鼻胃管、結腸鏡、胃鏡和食管胃十二指腸鏡來進行FMT[16,17]。一項系統評價顯示，通過保留灌腸或結腸鏡進行的FMT比通過胃鏡或鼻胃管更有效[18]。但在我們的研究中，大多數腫瘤患者希望通過口服來完成糞菌移植，這是因為口服比其他給藥途徑更便捷且易于接受。Zhang等[19]著力于糞菌凍干與膠囊制劑等技術研發，隨著糞便制備設備和口服膠囊制劑的工業發展，更多患者可能受益，不僅減少了傳統觀念下對糞便的顧慮，還考慮到患者的偏好，提高了用藥方便性，甚至療效。

既往研究表明腸道菌群與慢性應激存在直接關系[7]。本研究對11例腫瘤患者進行了腸道菌群多樣性組成和差異性物種分析，發現在無心理痛苦的腫瘤患者的腸道菌群中，Flavonifractor菌、Akkermansia菌、Anaeroglobus菌、Lachnoclostridium菌、Tyzzerella-3菌豐度均高于有心理痛苦組(P<0.05)。有研究表示，Flavonifractor菌是重要的腸道細菌，有助于緩解Th2主導環境中抗原特異性Th2的免疫應答，可以作為益生菌治療過敏反應[20]；Akkermansia菌擁有粘附粘液層的能力，可以保護腸道上皮細胞免受微生物攻擊，并為微生物提供生長能量，Akkermansia菌含量低可能導致腸屏障功能減弱，使毒素更容易侵入宿主。Akkermansia菌被認為是一種很有研究前景的益生菌[21]；Zhao等[22]發現橋本甲狀腺炎患者的Lachnoclostridium菌的數量比正常患者減小，說明Lachnoclostridium菌有利于機體的免疫應答；Zhou等[5]發現Tyzzerella-3菌的豐度水平與抑郁癥狀的嚴重程度之間存在負相關，而本研究發現心理痛苦組的糞便樣本中不存在Tyzzerella-3菌。以上這些研究結論與本研究結論類似，提示Flavonifractor菌、Akkermansia菌、Lachnoclostridium菌、Tyzzerella-3菌對腫瘤患者有益。Anaeroglobus菌是一種厭氧菌,F?k等[23]研究認為，口腔內大量的Anaeroglobus菌會加重全身炎性反應，不利于宿主健康，這與我們的研究結果不同，原因可能在于：研究對象不同，各研究對象在基礎疾病、年齡、生活飲食習慣等方面存在差異[24]。我們的研究結果顯示發生心理痛苦的腫瘤患者腸道菌群的組成發生了變化，特定菌屬可能會通過某種機制影響宿主的心理健康，這一發現為今后腸道菌群與腫瘤患者心理的機制研究開拓了思路。

綜上，本研究發現腫瘤患者愿意接受糞菌移植作為一種腫瘤綜合治療方法，有心理痛苦與無心理痛苦的腫瘤患者的腸道菌群組成存在差異，提示腸道菌群的組成會影響腫瘤患者的心理狀態，為開展腸道菌群與腫瘤心理應激之間的環路機制及調控因子的研究提供了新的思路和循證醫學依據，對臨床具有重要的參考價值。本研究局限性在于問卷調查和基礎實驗的樣本來自單中心，且樣本量較小，需要更大的樣本和更多更完善的動物實驗進一步驗證本研究結果的準確性。