電針對IBS-D模型大鼠結腸組織中PAR-2表達的影響*

鄭淑霞，許金森，陳苑平，陳 柯，薩喆燕，潘曉華

(福建省中醫藥科學院經絡研究所/福建省經絡感傳重點研究室，福建 福州 350003)

腹瀉型腸易激綜合征(diarrhoeal irritable bowel syndrome，IBS-D)是臨床最為常見的功能性胃腸病之一，因其癥狀遷延不愈，復發率高，嚴重影響患者生活質量，成為當前研究的熱點[1-2]。已有臨床和實驗研究[3-5]證實，針刺對IBS-D有較好的治療效果，能顯著改善IBS-D患者腹痛、腹瀉等腸道癥狀，恢復腸道功能。近年來，國內外研究發現PAR-2介導的信號通路在IBS的發病機制中起到重要影響，不僅參與胃腸道的運動功能，還可調節內臟的敏感程度，且越來越多的研究發現PAR-2在腸道黏膜通透性中亦起到重要作用。然而針刺對IBS-D腸道功能的調節作用是否與PAR-2有關，目前尚未有深入研究。因此本研究觀察了IBS-D模型大鼠結腸組織PAR-2 mRNA及蛋白表達的變化，探討電針干預IBS-D的可能機制，為電針治療IBS-D提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 健康成年的雄性SD大鼠32只，體質量(250±20)g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司動物提供(許可證號：SCXK(滬)2018-0006)。適應性飼養于福建省中醫藥科學院實驗動物中心7 d后分組飼養，溫度為(23～26)℃，相對濕度為50%～70%。

1.2 實驗試劑及儀器 番瀉葉生藥(亳州市華鑫中藥飲片科技有限公司)，液體石蠟(運加牌，黑龍江省運加醫療科技有限公司)，AG RNAex Pro RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉錄試劑盒、SYBR? Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)，PAR-2一抗(英國 Abcam公司)，GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(H+L)(北京博奧森生物技術有限公司)，8FR導尿管(事達牌，湛江市事達實業有限公司)，2 mL注射器(康友牌，江蘇康友醫用器械有限公司)，電子秤(福建福日電子股份有限公司)，R407小動物呼吸麻醉系統(瑞沃德生命科技有限公司)，異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)，SDZ-Ⅱ型電針儀(華佗牌，蘇州醫療用品廠有限公司)，0.25 mm×13 mm無菌針灸針(華成牌，蘇州東邦醫療器械有限公司)，NANODROP RNA質量檢測儀(美國Thermo公司)，Veriti梯度PCR儀(美國ABI公司)，ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)，冷凍高通量組織研磨儀(浙江美壁儀器有限公司)。

1.3 分組與造模 32只大鼠適應性飼養7 d后，隨機分成對照組、對照電針組、模型組及模型電針組，每組8只。對照組、對照電針組大鼠正常喂養，余下2組則需進行2w的IBS-D造模處理。參照Williams等[6]的方法進行改進，采用慢性束縛應激聯合番瀉葉灌胃的方法建立IBS-D大鼠模型，并參照趙妍等[7]的方法制備0.3 g/mL的番瀉葉煎劑。造模時先給予番瀉葉煎劑(0.3 g/mL)，并按照10 mL/kg的給藥劑量灌胃。灌服番瀉葉煎劑后，將大鼠裝進自制的固定器中，限制其無法進行自如活動，持續時長為1h，每日1次，持續2w。以模型組大鼠腹瀉指數與大便Bristol評分、直結腸擴張(colorectal distension，CRD)容量閾值與空白組差異具有統計學意義為造模成功的標準。

1.4 干預方法 對照電針組和模型電針組在造模成功后對大鼠的足三里穴進行電針干預，將大鼠固定在自制固定器內，使其不亂跑亂動，參照實驗針灸研究會制定的《實驗動物針灸穴位圖譜》，選取大鼠的足三里穴。選用規格為0.25 mm×13 mm的毫針直刺，深度約為5 mm，并接上電針儀，選用疏密波，頻率2 Hz，強度為1～2 mA，以大鼠下肢出現輕微抖動且不嘶叫為度，留針20 min，每日1次，持續7d。

1.5 觀察指標和檢測方法

1.5.1 一般情況 觀察大鼠在實驗過程中的精神狀態、活動情況、毛發光澤度以及體重增長等情況。

1.5.2 腹瀉情況 在大鼠造模前后以及干預后，對所有大鼠進行腹瀉指數的測算。腹瀉指數測定時在鼠籠內墊上濾紙，定時觀察大鼠排便情況，如有稀便污跡沾染濾紙則需更換濾紙，并及時記錄濾紙的污跡面積。持續觀察5h后，統計大鼠排稀便的數量及腹瀉情況，再根據公式計算每只大鼠的腹瀉指數[8]。

腹瀉指數=稀便率(每只大鼠的稀便數/總便數)×稀便級(每只大鼠的稀便級數總和/稀便數)。

稀便級數分級[4]：以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級，分為4級：1級為污染直徑<1 cm，2級污染直徑1.0～1.9 cm，3級污染直徑2～3 cm，4級污染直徑>3 cm。統計每個大鼠排便的總數，再統計大鼠排稀便的總數，并逐一測定每堆稀便的級數，然后參照公式算出腹瀉率、稀便級以及腹瀉指數。測量污染直徑時，如果糞便形狀大致為圓形，則可以直接量直徑；若糞便形狀為橢圓形或較不規則時，則測量其最長距離和近似圓的直徑，并將二者相加除以2，即為最后的直徑。

Bristol評分：參照Bristol分型積分[9]，對大鼠的糞便形態逐一進行評分，統計后取積分的平均值。

1.5.3 內臟敏感性評價 在造模前、造模后及干預后，先將大鼠禁食12 h，將所有大鼠逐個放入小動物呼吸麻醉誘導盒內，使其吸入異氟烷麻醉。待其麻醉后將帶有球囊的8FR導尿管插入大鼠肛門內，導尿管插入深度為4.5 cm，隨后用膠帶將其纏在大鼠尾巴上固定。將大鼠放入規格為200 mm×80 mm×80 mm的透明固定盒中，并將含有溫生理鹽水的2 mL注射器接入導尿管尾部，待大鼠完全清醒后盡快檢測大鼠的內臟敏感性。測量結直腸擴張時，緩慢向球囊內注溫生理鹽水，使球囊內的壓力逐漸增高，記錄大鼠出現腹壁收縮反應及腹部、臀部抬高并抬離地面時的容量閾值，需重復3次該操作，并取平均值。

1.5.4 熒光定量 PCR法檢測結腸組織PAR-2 mRNA的表達：稱取大鼠自肛門上6 cm處的結腸組織50～100 mg，剪碎，放入低溫研磨機中進行組織研磨，用AG RNAex Pro RNA提取試劑盒提取結腸組織總RNA。用Evo M-MLV反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR? Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒提供的反應體系進行PCR擴增。PCR反應體系：各基因對應上下游引物(引物序列見表1)各0.4 μL，2×SYBR? Green Pro Taq HS Premix 10 μL，cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，最后加RNase free water到20 μL。PCR反應條件：95 ℃ 30s；95 ℃ 5s，60 ℃ 30s，40個循環。以GAPDH為內參，運用2-△△Ct公式計算目標mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.5.5 Western blot法檢測結腸組織 PAR-2蛋白相對表達量：稱取大鼠自肛門上6 cm處的結腸組織50～100 mg，加入適量的RIPA裂解液和適量的PMSF溶液，并放入研磨機內進行研磨、裂解。4℃、14000 rpm離心15 min，取上清液，得到總蛋白溶液。利用NANODROP RNA質量檢測儀進行總蛋白濃度測定，經過電泳，通過轉膜裝置恒流轉膜，按照轉膜海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜(經甲醇活化后)-濾紙-轉膜海綿的順序，持續轉膜45 min。轉膜結束后，TBST溶液中漂洗1 min，后再放入QuickBlock? Western封閉液內進行約30 min的封閉處理。加入經抗體稀釋液稀釋的一抗(PAR-2抗體(兔單克隆抗體)按1∶10000稀釋，TRPV1抗體(兔多克隆抗體)按1∶1000稀釋，GAPDH抗體按1∶1000稀釋)，4 ℃緩慢搖動孵育過夜后，用TBST溶液漂洗3遍，加入1∶20000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG)溶液中室溫孵育1 h，結束后用TBST溶液漂洗5遍，加入發光試劑盒中A液與B液，將膜放入化學發光成像儀內進行顯影。顯現結束后得到的條帶用分析軟件進行灰度值測定。以GAPDH為內參蛋白，目的蛋白與GAPDH的比值為其相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模前，各組大鼠精神狀態良好，活潑好動，皮毛白凈順滑光澤，眼角口鼻干凈，耳廓呈淡粉色，大便干稀適中。造模結束后，與對照組相比，模型組和模型電針組的大鼠日常處于易激惹狀態，弓身豎毛，躲避、畏懼，對周圍動靜十分警惕，進食量相對減少，毛色偏黃，較為粗糙無光澤，肛周及尾部可見明顯污穢附著。對各組大鼠在造模與電針干預前后體重值進行比較，如表2所示，造模前各組體重比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；造模后，與對照組相比，對照電針組大鼠體重有所降低，差異不明顯，模型組與模型電針組的大鼠體重都明顯降低(P<0.01)；電針干預后，與對照組相比，對照電針組大鼠體重有所降低，差異不明顯；與模型組相比，模型電針組大鼠的體重明顯高于模型組(P<0.01)。

表2 各組大鼠體重值比較

2.2 各組大鼠的腹瀉指數與大便Bristol評分比較 如表3所示，與對照組相比，模型組大鼠的腹瀉指數與Bristol評分明顯高于對照組(P<0.01)，而對照電針組大鼠的腹瀉指數、Bristol評分與對照組相比未見有統計學差異；與模型組比較，模型電針組大鼠的腹瀉指數、Bristol評分明顯低于模型組(P<0.01)。

表3 各組大鼠大便的Bristol評分和腹瀉指數

2.3 各組大鼠的內臟敏感性評價比較 直結腸擴張(colorectal distension，CRD)容量閾值包括腹部收縮、腹部抬高、臀部抬高的容量閾值，各組大鼠CRD容量閾值比較結果見表4。與對照組相比，對照電針組的腹部收縮、腹部抬高、臀部抬高的容量閾值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；模型組大鼠腹部收縮和腹部抬高的容量閾值明顯降低(P<0.01)，模型組大鼠的臀部抬高閾值低于對照組(P<0.05)；與模型組相比，電針組大鼠出現腹部收縮和腹部抬高的容量閾值明顯升高(P<0.05)。

表4 容量閾值

2.4 各組大鼠的腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)評分結果 如表5所示，與對照組相比，模型組大鼠在1 mL容量時的評分明顯高于對照組(P<0.01)、在1.5 mL容量時的評分也高于對照組(P<0.05)；與模型組比較，模型電針組的評分呈現降低趨勢，電針組大鼠在1 mL容量時的評分低于模型組(P<0.05)、在1.5 mL容量時的評分也明顯低于模型組(P<0.01)。

表5 腹壁撤反射評分

2.5 各組大鼠結腸中PAR-2的mRNA及蛋白相對表達量比較 如表6和圖1所示，與對照組相比，模型組大鼠PAR-2的mRNA及蛋白的相對表達量明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，模型電針組大鼠的PAR-2的mRNA及蛋白的相對表達量均有所降低，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠PAR-2的mRNA及蛋白相對表達量比較

圖1 各組大鼠PAR-2蛋白Western blot電泳圖

3 討論

IBS是一種與多因素相關的疾病，具有復雜的潛在發病機制，至今尚未有完整、確切的解釋。目前，內臟高敏感是對該病的發病機制闡述中較普遍的認識之一。中醫學將IBS-D歸為“泄瀉”“腹痛”的范疇，肝失疏泄、脾胃虛弱是主要病機[10]。足三里屬胃經合穴、胃下合穴，可補中益氣，通過相關的數據分析結果顯示，臨床上針刺治療IBS-D時，足三里穴是使用頻率較高的穴位之一[11]。研究表明，電針足三里穴可明顯糾正偏于正常生理狀態的胃腸功能抑制狀態，對胃腸功能起促進作用[12]。本實驗結果顯示，電針組大鼠的腹瀉指數、Bristol評分明顯降低；CRD容量閾值明顯升高；AWR評分明顯降低，表明電針足三里能降低IBS-D模型大鼠的內臟敏感，并改善其腹瀉情況。

隨著IBS生理病理研究的不斷深入，近年來，國內外研究發現PAR-2介導的信號通路在其發病機制中起到重要影響。PAR-2存在于體內多種組織或器官中，其在胃腸道內分布較為廣泛，同時胃腸道內含有多種能激活PAR-2的蛋白酶，被激活后的PAR-2會產生多種能影響消化系統功能的生物學效應，且被認為與多種消化系統疾病有密切的聯系。已有的研究[13-17]發現：PAR-2在控制人結腸黏膜通透性中起著重要作用，PAR-2活性的增加是IBS直腸黏膜通透性增加的原因之一；IBS-D患者的糞便中的蛋白酶活性較高，推斷PAR-2與IBS-D的發病存在一定的聯系，并且還發現當外源性的PAR-2激動劑在大鼠體內發生作用時，內臟敏感的閾值會呈現降低的趨勢；IBS患者腸組織中PAR-2的表達量較健康人升高；PAR-2受體信號傳導可能是IBS-D患者中傷害感受器持續過度興奮的基礎，IBS小鼠模型中PAR-2的激活能增加腸道通透性，并且導致免疫激活和內臟超敏反應。本實驗結果顯示，模型組大鼠PAR-2的mRNA及蛋白的相對表達量明顯增多，而電針可以降低其表達。由此推測，IBS-D的發病機制可能與PAR-2存在密切聯系，電針足三里穴改善IBS-D模型大鼠的腹瀉及內臟高敏感可能與PAR-2的表達水平降低有關。而PAR-2及其相關的信號通路如何在電針過程中發揮作用，還有待于今后的進一步研究。